Name: Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende a inducir lesiones precisas en músculo esquelético embrionario de pez cebra mediante láser de alta energía. Este método permite estudiar la regeneración muscular in vivo mediante marcaje genético y microscopía confocal.

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Damos las gracias a Bob Nowak (Andor Technology) para la ayuda técnica y asesoramiento. SA-S. con el apoyo de una beca Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabajo fue apoyado por la DFG subvención SE2016/7-1.

1. Etiquetado de células individuales Inyectar una célula de embriones etapa con un plásmido que codifica GFP o cualquier proteína GFP-fusión bajo el control de un promotor de β-actina. Durante el desarrollo, la GFP se expresa entonces en forma de mosaicos. Aquí, se utilizó el constructo transgénico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], que coloca la proteína de fusión α-actinina-GFP bajo el control del promotor de la β-actina. 2. Embriones Embedding <ol class="lalpha"><li> Recoger embriones de pez cebra y mantener en condiciones normales hasta 28 HPF (puesta en escena de acuerdo a 12). </li><li> Embriones Dechorionate bajo el microscopio estereoscópico con fórceps (Dumont # 5). </li><li> Preparar un portaobjetos de microscopio con un anillo de vaselina. </li><li> Preparar un 1% de bajo punto de fusión de agarosa / 10% de solución de tricaína con medio E3: hervir 100 mg de agarosa en 10 ml de solución de E3 para obtener un líquido homogéneo y solución de agarosa; alícuota y tiendasin utilizar una solución de agarosa a -20 ° C para su uso posterior. Para uso inmediato, dejar que la solución se enfríe hervida y mantener en el máximo. 39 ° C. Añadir la solución de stock de tricaína para obtener una concentración final de 10% tricaína. Tanto tricaína y agarosa son necesarias para evitar los movimientos embrionarios. </li><li> Insertar un solo embrión en 1% de agarosa de bajo punto de fusión / 10% tricaína / E3 medio dentro del anillo de la jalea de petróleo, con el embrión por el que se forma natural en el lado; suavemente un cubreobjetos, sólo para mantener el embrión en su lugar y para evitar un convexo superficie que se rompería la luz. Idealmente, el tejido muscular embrionario que se dirigirá debe tocar el cubreobjetos. </li></ol> 3. Embriones láser heridas <ol class="lalpha"><li> Preparar el láser micropoint y el microscopio: <ol class="lroman"><li> Por favor, consulte el manual de micropoint láser para obtener instrucciones detalladas sobre cómo configurar y utilizar el láser en conjunción con el microscopio. </li><li> Seleccionar la adecuadacolorante para la generación de un haz de láser 435 nm de longitud de onda. </li><li> Ajuste la potencia del láser mediante el control deslizante de atenuación. La potencia del láser debe ser lo suficientemente fuerte como para romper una superficie de vidrio con un solo pulso (por ejemplo, el enfoque sobre el cubreobjetos de la muestra para probar esto). Esta es la potencia de láser requerida para la ablación celular. </li></ol></li><li> Centrarse en la región o célula de interés utilizando la retícula instalada en el ocular del microscopio. Utilice un objetivo de 20x (40x permitirá daños más precisa, pero a menudo la distancia de trabajo no es suficiente para este objetivo). </li></ol> Nota 1: El láser no sólo se lesionan las células dentro del plano de enfoque, pero también células por encima y por debajo que están dentro del haz de láser. Asegúrese de que antes del experimento que el láser está óptimamente configurado y ajustado para un enfoque alcanza su máximo en el eje z. Lo mejor es determinar la profundidad de la lesión con láser antes de realizar el experimento con el fin de saber qué células exactamente se lesionó. <ol class="lalpha" start="3"><li> Configure la luz necesaria para visualizar el experimento: campo claro para el uso normal, o si la orientación de fluorescencia de una célula fluorescente etiquetados. </li><li> Enviar un pulso de luz láser a la región objetivo, o varios impulsos, dependiendo del grado deseado de lesión. </li></ol> 4. Análisis de las heridas y la recuperación <ol class="lalpha"><li> Si se desea, el procedimiento de lesión láser puede ser grabado en vivo (por ejemplo, utilizando la opción de adquisición corriente del software Metamorph). 6 </li><li> Inmediatamente después de la herida, el embrión debe ser removido suavemente de la agarosa con pinzas y se coloca de nuevo en agua para la recuperación de huevo. </li></ol> Nota 2: La actividad muscular (natación y contracciones) es especialmente importante para la recuperación del músculo esquelético. Dado que el embrión no puede moverse debido a la exposición tricaína y la incrustación de agarosa rígido, no es RECOMEnded para mantener los embriones de un portaobjetos y un cubreobjetos durante demasiado tiempo. <ol class="lalpha" start="3"><li> Después de la recuperación, el embrión puede ser fijada y se analizaron como se desee por la luz, microscopía de fluorescencia confocal o-como se indica. </li></ol>

<ol><li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).</li>
<li>Steffen, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+runzel+muscular+dystrophy+is+linked+to+the+titin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene.</a> Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).</li>
<li>Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+mutants+to+identify+secondary+target+effects+of+acetylcholine+esterase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors.</a> Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).</li>
<li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xirp+proteins+mark+injured+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish.</a> PLoS One. 7, e31041(2012).</li>
<li>Roostalu, U., Strähle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).</li>
<li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somite+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Somite development in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).</li>
<li>Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+somite+cell+rearrangements+lead+to+distinct+waves+of+myotome+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth.</a> Development. 134, 1253-1257 (2007).</li>
<li>Choi, W. Y., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).</li>
<li>Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+dedifferentiation+provides+replacement+tissue+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Laser lesión mediada es un método poderoso para infligir heridas de un tamaño deseado mediante la ablación de las células con el fin de estudiar la regeneración bajo condiciones controladas en el embrión de pez cebra. En particular, las células pueden ser dirigidos con precisión (Figura 2) y tanto el área de la lesión así como de temporización puede ser controlada. Posteriormente, el sitio de la lesión y los procesos de regeneración son fácilmente controlados, registrados (Figura 3) y a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Calefacción bloque </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Par N º 5 fórceps </td><td> Dumont </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Menzel </td><td></td><td> 76 x 26 mm </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Roth </td><td></td><td> 50 x 24 mm # 1 </td></tr><tr><td> Jalea de petróleo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td> Leica </td><td></td><td> MZFLIII </td></tr><tr><td> Micropoint láser </td><td> Andor Tecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Axioplan II </td></tr><tr><td> El software Metamorph </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivos <ul><li> Bajo punto de fusión de agarosa (# 50081,Lonza) </li><li> Tricaína solución madre: 400 mg tricaína (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml dH 2 O pH 9,0 </li><li> Medio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4) </li></ul></td></tr></tbody></table>

laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Varios enfoques experimentales se han utilizado en ratón para inducir lesión muscular con el objetivo de estudiar la regeneración muscular, incluyendo inyecciones myotoxin (bupivacaína, cardiotoxina o notexin), trasplantes musculares (denervación-desvascularización regeneración inducida), el ejercicio intenso, sino también modelos murinos de distrofia muscular como el ratón mdx (para una revisión de estos enfoques ver 1). En el pez cebra, los enfoques genéticos incluyen mutantes que exhiben fenotipos de distrofia muscular (como runzel 2 o sapje 3) y antisentido morfolinos de oligonucleótidos que bloquean la expresión de genes asociados a la distrofia 4. Además, los enfoques químicos también son posibles, por ejemplo, con la galantamina, un compuesto químico inhibiendo la acetilcolinesterasa, resultando así en hipercontracción, que finalmente conduce a la distrofia muscular 5. Sin embargo, los enfoques genéticos y farmacológicos generalmente afectar a todos los músculos dentro de un individuo, mientras que la extensión de las lesiones infligidas físicamente son más fácilmente controlados espacial y temporalmente 1. Lesión física localizada permite la evaluación de músculo contralateral como control interno. De hecho, recientemente hemos utilizado láser mediada por ablación celular para estudiar la regeneración del músculo esquelético en el embrión de pez cebra 6, mientras que otro grupo informó recientemente el uso de un láser de dos fotones (822 nm) a dañar muy localmente la membrana plasmática de músculo individual embrionario de pez cebra células 7. Aquí, se presenta un método para utilizar el láser micropoint (Andor Technology) para lesión celular del músculo esquelético en el embrión de pez cebra. El láser micropoint es un láser de alta energía, que es adecuado para la ablación de células reconocidas en una longitud de onda de 435 nm. El láser está conectado a un microscopio (en nuestra configuración, un microscopio óptico de Zeiss) de tal manera que el microscopio se puede utilizar en el mismo tiempo fo enfocar la luz láser sobre la muestra y para la visualización de los efectos de la herida (campo claro o fluorescencia). Los parámetros para el control de pulsos de láser incluyen longitud de onda, intensidad, y número de pulsos. Debido a su transparencia y el desarrollo embrionario externo, el embrión de pez cebra es altamente susceptible, tanto para la lesión inducida por láser y para el estudio de la recuperación posterior. Entre 1 y 2 días después de la fecundación, las células del músculo esquelético somitic someterse a la maduración progresiva de anterior a posterior debido a la progresión de somitogenesis desde el tronco hasta la cola 8, 9. En estas etapas, los embriones espontáneamente crispar e iniciar la natación. El pez cebra se ha reconocido recientemente como un organismo vertebrado importante modelo para el estudio de la regeneración de los tejidos, como muchos tipos de tejidos (cardiacas, neuronal, vascular, etc) se puede regenerar después de la lesión en el adulto pez cebra 10, 11.

Laser lesión mediada se realizó en inmovilizadas 1 día de edad embriones. Como se muestra en la Figura 1, un láser de pulsos pocos puede generar una pequeña herida, fácilmente reconocible por los dañados, enrollados, actina ricos en miofibrillas que normalmente se extendía entre los límites somite. Un mayor número de pulsos de láser sin embargo resultará en un bloque de somite dañado masivamente, en donde la mayoría de las miofibrillas son destruidos. No obstante, se puede observar que, literalmente, &q...

El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Se han empleado diversos enfoques experimentales en ratones para inducir lesiones musculares con el objetivo de estudiar la regeneración muscular, incluidas las inyecciones de miotoxinas...

El objetivo general de este procedimiento es inducir daño precisamente controlado en el músculo esquelético embrionario de pez cebra, con el fin de estudiar los procesos de regeneración muscular. Esto se logra primero mediante la marcación genética de células individuales del músculo esquelético de forma mosáica. A continuación, los embriones seleccionados se incrustan en agros suministrado con trica sobre un portaobjetos.Luego, los embriones se colocan bajo el microscopio y se lesionan células musculares específicas mediante un láser de punto microscópico. Finalmente, los embriones se retiran de los agros y se les permite recuperarse durante períodos de tiempo definidos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la organización miofibrilar mediante la lesión con láser seguida de microscopía confocal.El método que presentamos hoy es relevante para el campo de la regeneración muscular, pero también puede aplicarse a otros paradigmas de regeneración, como la regeneración de aletas y el pez cebra. Para etiquetar células, inyecte embriones de un solo estadio celular con un plásmido que codifique GFP o cualquier proteína de fusión GFP bajo el control de un promotor ubicuo o específico de tipos celulares. Durante el desarrollo, GFP se expresa entonces de manera mosáica dentro de los tejidos. En este ejemplo, el plásmido inyectado hace que células musculares individuales expresen alfa actina en GFP.Bajo el control del promotor de beta actina, incubar los embriones hasta 28 horas post fertilización. A continuación, bajo un microscopio de disección equipado con una lámpara fluorescente para detectar actinina, usar pinzas para recubrir los embriones y preparar una solución al 1% de agarosa de punto de fusión baja al 10% en medio E tres, hirviendo 100 miligramos de agarosa en 10 mililitros de medio E tres.Deje que la solución se enfríe a 39 grados Celsius y agregue trica hasta una concentración final del 10 %. Luego, prepare un portaobjetos de microscopio con un anillo de vaselina. Después de agregar la solución de agarosa de punto de fusión baja al anillo de vaselina bajo el microscopio, incruste un embrión individual en la agarosa de punto de fusión baja dentro del anillo de vaselina. Con un cubreobjetos, cubra suavemente el embrión y colóquelo paralelo al cubreobjetos para obtener una vista lateral perfecta.Para preparar el láser de micro punto, consulte el manual del láser de micro punto para obtener instrucciones detalladas sobre cómo configurar y utilizar el láser. En conjunto con el microscopio, seleccione el tinte láser CUMERIN cuatro 40 para la generación de un haz láser con una longitud de onda de 435 nanómetros. Utilice el control deslizante de atenuación para ajustar la potencia del láser.La potencia del láser necesaria para la ablación debe ser suficientemente intensa como para romper una superficie de vidrio con un solo pulso. Consulte las instrucciones del fabricante para obtener más detalles sobre el ajuste del láser utilizando el puntero rojo instalado en el ocular del microscopio. Enfóquese en la región o célula de interés.A continuación, prepare la luz necesaria para visualizar la muestra. Luego, aplique uno o varios pulsos de luz láser a la región diana, según el grado de lesión deseado. Inmediatamente después de la herida, use una pipeta para retirar suavemente el embrión del agar y colóquelo de nuevo en agua de huevo para su recuperación.Después de un período de recuperación durante el tiempo deseado, fije el embrión, realice inmunohistoquímica y analice mediante microscopía confocal. La lesión inducida por láser se realizó en embriones inmovilizados de un día de edad. Las tinciones de actina muestran que unos pocos pulsos láser pueden generar una pequeña herida, fácilmente reconocible por los miofibrilos dañados que aparecen como espirales de actina. Un mayor número de pulsos láser dará como resultado somitas gravemente dañadas, en las que la mayoría de los miofibrilos quedan destruidos tras cinco horas de recuperación.Las tinciones de actina muestran que los miofibrillas dentro de los sitios de lesión pequeños se han recuperado y atraviesan todo el ancho del mite. Descubrimos que la velocidad de recuperación depende del tamaño del tejido dañado, siendo las lesiones pequeñas las que sanan más rápido que las grandes. Se puede obtener información adicional tiñendo el tejido lesionado con un anticuerpo contra SERP uno, que se localiza a lo largo de los miofis en recuperación.Dentro de las células musculares dañadas en el sitio de la lesión láser indicado por un rayo rojo, la célula ablacionada presenta una fluorescencia GFP reducida. Esta figura demuestra que, tras la fase de recuperación de la lesión y la tinción con anticuerpos, la célula diana señalada por la flecha blanca es reconocida en función del patrón de células marcadas de forma mosaicada que la rodean, como indican las flechas amarillas. El enfoque aquí mostrado permite seguir con el tiempo cómo la lesión mediada por láser afecta a las células musculares semíticas.Las células se registran en vivo para evaluar los efectos inmediatos dentro de los primeros minutos tras la lesión con láser. Luego, se pueden realizar grabaciones con intervalos de tiempo durante cualquier período deseado para seguir de cerca cómo las células se reorganizan alrededor de las heridas. En este ejemplo de imagenología en vivo, la flecha negra indica dónde el láser lesiona el músculo semítico a las 30 HPF.Los extremos de una célula muscular dañada se están retrayendo lentamente hacia los límites del miosito a la izquierda y a la derecha de la flecha negra. Este método puede utilizarse en conjunto con otras técnicas, como la Q-R-T-P-C-R o el Western Blot, con el fin de determinar cambios en la expresión génica o en la expresión de proteínas. Además, se puede realizar un análisis de lapsos de tiempo para investigar, por ejemplo, la respuesta inmunitaria tras una lesión orgánica.Por lo tanto, este método tiene realmente muchas aplicaciones posibles.

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