Name: El insecto Galleria mellonella Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Aprende a infectar larvas de Galleria mellonella con bacterias patógenas mediante inyección intrahemocélica o alimentación forzada. Este modelo alternativo permite estudiar la virulencia bacteriana y las interacciones huésped-patógeno sin problemas éticos.

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Nos gustaría dar las gracias a Elisabeth Guillemet, Buisson Christophe y Ludovic Bridoux por su excelente asistencia técnica. Estamos en deuda con Sylvie Salamitou y Fedhila Sinda para la configuración inicial del sistema.

1. La cría de insectos El ciclo completo de huevo a larvas de último estadio dura alrededor de 5 semanas a 25 ° C. Una o dos semanas adicionales son necesarios para obtener las mariposas adultas. <ol><li> Coloque por lo menos 100 pupas o adultos recién fusionada G. mariposas mellonella en un 5-litros de malla de alambre jaula. Mariposas macho medir 10 a 15 mm. La polilla macho adulto es de color beige con luz tenue y marcas oscuras. Mariposas medida Femenino alrededor de 20 mm. Las hembras son más oscuras que los machos con un color marrón / gris. </li><li> Suspender dos paquetes de cuatro capas de papel en la jaula para la puesta de huevos. Después de 2 días, la hembra adulta se ponen los huevos en el borde entre los papeles. </li><li> Dos veces por semana, coloque los paquetes de papel de huevo en las nuevas cajas de crianza de plástico con rejillas para que el aire circule, que contiene polen y cera de abeja. Los huevos eclosionan en unos 3 días y pequeñas larvas comienzan a desarrollarse alimentándose de cera y polen. Alternativamente, larvas se colocan sobre una dieta artificial consisting de una mezcla de miel líquida 500 g, 400 g de glicerina, 100 g de levadura de cerveza seca, harina de trigo 250 g, 200 g de leche en polvo descremada y 400 g polenta. Proporcionar proporción adecuada de alimento por larvas, regularmente separar las larvas en cajas nuevas y reponer la comida cada dos días. </li><li> Las larvas se crían durante las seis etapas del estadio de larva. Cada estadio se caracteriza por el deslizamiento de la cápsula de la cabeza de las larvas. Cuando las larvas alcanzan la última etapa antes de la pupación, dejan de alimentarse y empezar a construir un capullo de seda. </li><li> En sus capullos protectores, las larvas se apoyará y se transforman en pupas. Gusanos de cera permanecerá en la fase de pupa de una a dos semanas para emerger en polillas adultas. Las polillas adultas no beber ni comer. El apareamiento se produce y el ciclo de los gusanos de cera &quot;la vida comienza de nuevo. </li><li> Para estandarizar el ensayo de patología, tomar las larvas durante la etapa larval pasado. Durante esta etapa dejan de alimentarse, moverse a la tapa de la caja de la cría y empezar a producir seda. Este stage dura alrededor de 5 días. </li></ol> 2. Selección de insectos para la infección <ol><li> Seleccione último estadio larvario, que son de 2-3 cm de largo y 180-250 mg de peso, 24 horas antes de las infecciones y los puso en una caja vacía a morir de hambre. </li><li> Quitar el capullo de seda alrededor de la naciente larvas. </li></ol> 3. Preparación bacteriana <ol><li> Preparar suspensiones bacterianas de Bacillus para obtener concentraciones finales que varían desde 10 4 unidades formadoras de colonias (ufc) / ml a 10 8 ufc / ml para inyección intra haemocoelic y de 3x10 6 ufc / ml a 1x10 8 ufc / ml para la ingestión (el ufc para obtener un LD 50 depende de la especie bacteriana). En nuestro caso, B. cereus se cultiva en medio Luria-Bertani caldo (LB, 10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto de levadura, 10 g / l de NaCl) a 37 ° C bajo agitación hasta que la entrada en fase estacionaria, correspondiente a la incurvación del crecimiento curva. Mida las OD 600 nm (entre 1 y 2 por B. cereus) y se utilizan para evaluar la concentración bacteriana, utilizando una curva de valoración previamente hecha. Cosecha bacterias por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a temperatura ambiente y se resuspende en tampón fosfato salino (PBS: 1 M KH 2 PO 4, 1M K 2 HPO 4, 5 M NaCl, pH 7,2). Cada larva recibirá 10 l de suspensión bacteriana en la concentración deseada. </li><li> Alternativamente, la suspensión de esporas se pueden preparar para la infección. Obtener esporas cultivando las bacterias en el medio de esporulación HCT (5 g / L de triptona, 2 g / L de hidrolizado de caseína, 12,5 mM K 2 HPO 4, 12,5 mM MgSO 4, 0,05 mM MnSO 4, 1,2 mM de ZnSO 4, 1,2 mM Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% H 2 SO 4, 25 mM CaCl 2) 20 a 30 ° C durante 3 días. Esporas cosecha por centrifugación (10.000 xg, 15 min) y lavar dos veces en agua destilada estéril. Resuspender el pel esporasdejar en agua destilada estéril y calor durante 15 min a 78 ° C para eliminar el resto de las bacterias vegetativas. Numerate la suspensión mediante siembra de diluciones seriadas en placas de agar LB. Cada larva recibirá 10 l de suspensión de esporas a la concentración deseada. </li></ol> 4. Preparación de toxina Cry <ol><li> Preparar la toxina Cry1C de la B. thuringiensis cepa 407 transformada con el plásmido 21 pHTF31C llevar el gen que codifica Cry1C. Cultivar la cepa en medio HCT 100 ml a 30 ° C durante 72 horas con antibióticos (eritromicina 10mg/ml) para permitir la esporulación completa, la producción de toxina de cristal y la liberación en el sobrenadante del cultivo. </li><li> Purificar cristales del sobrenadante en un gradiente de sacarosa 72% -79%. En primer lugar añadir 17 ml de 79% de sacarosa en un tubo de 40 ml. Cuidadosamente capa 17 ml de 72% de sacarosa en la parte superior de la sacarosa del 79%. Finalmente, la capa de 5-6 ml del cultivo esporulado concentrado 10 veces y cerrar el tubo. Se centrifuga el tubo durante 14 horas a 20,000 xg, 4 º C, para separar los cristales de las esporas. Recoger los cristales en la interfaz de gradiente. Resuspender el precipitado de cristales en 25 ml de agua estéril fría para lavar. Centrifugar a 8.000 xg durante 20 min. Este paso se repitió tres veces para eliminar todo sacarosa se pegue a los cristales. Resuspender los cristales en 5 ml de agua estéril y observar al microscopio para evaluar la pureza. </li><li> Evaluar la concentración de toxina de proteína por tinción clásica Bradford en solución de cristal presolubilized en 50 mM NaOH. Cristales de toxina puede ser almacenado a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 5. Inyector de Preparación <ol><li> Para controlar el volumen de inyección precisa, utilizar una bomba de jeringa automatizada (por ejemplo, KD Scientific KDS 100) con una velocidad de configuración a 1 l / seg (Figura 1A). </li><li> Llene una jeringa de 1 ml hipodérmica con 300 l de agua o la solución bacteriana (1 jeringa por condición) para la infección de larvas de 20-25. Eliminar las burbujas con cuidado tapping la jeringa, después coloque un 0,45 x 12 mm aguja a la jeringa. </li><li> Coloque la jeringa en el inyector. </li><li> Realizar una inyección en blanco de 10 l en un tubo de vacío para controlar el volumen inyectado. </li></ol> 6. Inyección Intrahaemocoelic insectos <ol><li> Coloque el insecto manualmente entre el pulgar y el índice. A continuación, insertar la aguja fijada en el inyector en la piel larva (cutícula) (Figura 1C). </li><li> Mantenga el insecto en su lugar mientras se inyecta la solución 10 l bacteriana (bacterias o esporas vegetativo). </li><li> Retire con cuidado el insecto de la aguja. </li><li> Coloque el insecto infectado en una pequeña placa de Petri (5 cm de diámetro), 5 larvas por plato. </li><li> Infect al menos 20 larvas para cada condición experimental. </li><li> Colocar las cápsulas a 37 º C en una incubadora durante 48 hr. </li></ol> 7. La alimentación forzada de insectos (Ingestión) <ol><li> En un tubo Eppendorf de 2 ml, mezclar 0,2 g / &amp; mu; l de la toxina Cry1C con cualquiera de suspensión de células o esporas vegetativo para obtener concentraciones finales que van desde 3x10 a 1x10 4 7 por 10 l. </li><li> Llene una jeringa de 1 ml con un 30 G, 25 mm aguja hipodérmica con 300 l de la solución de toxina bacteriana-Cry1C en la infección de larvas de 20-25. Eliminar las burbujas de la jeringa. </li><li> Coloque el insecto manualmente de modo que su boca entra en la aguja fija en el inyector (Figura 1D), y alimentar a la fuerza con 10 l de la solución bacteriana usando la bomba de jeringa automatizada. </li><li> Infect al menos 20 larvas para cada condición experimental. </li><li> Coloque el insecto infectado en un pequeño plato Petri de 5 cm (5 larvas por plato). Colocar las cápsulas a 37 º C en una incubadora durante 48 hr. </li></ol> 8. Grabación de la mortalidad de insectos <ol><li> Después de los experimentos de alimentación forzada o de inyección, mantener las larvas en la placa de Petri sin alimento a 25 ° C o 37 ° C. Compruebe larval mortality regularmente durante un período de 48 horas. Larvas muertas son inertes y por lo general vuelve negro (fig. 1B). </li><li> Los datos de mortalidad se pueden analizar utilizando el programa de log-probit 14. Este programa pone a prueba la linealidad de las curvas de mortalidad de dosis y proporciona dosis letales (LD 50). Alternativamente, otros programas, tales como Prism (Graph Pad), analizando la supervivencia o los datos de mortalidad se puede utilizar. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El uso de insectos y especialmente la etapa larval, como modelos de infección para los varios patógenos, se está convirtiendo frecuente. Un modelo de elección para algunos aspectos es Drosophila (mosca del modelo) que se utiliza como adultos y 1,2 etapa larval. El insecto lepidóptero G. mellonella también se ha utilizado principalmente para ensayar la virulencia bacteriana por inyección. La ventaja de tolerar temperaturas más altas (por encima de 37 ° C) que en Drosophila (máximo 25...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Cera y polen </td><td> La Ruche Roanaise </td><td> 303000 </td><td> Los productores de miel </td></tr><tr><td> Bomba de jeringa automatizada </td><td> KD Scientific </td><td> KDS 100 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa 1 ml </td><td> Terumo </td><td> BS 01T </td><td></td></tr><tr><td> Aguja de 0,45 x 12 mm </td><td> Terumo </td><td> NN 2613R </td><td></td></tr><tr><td> Placa de Petri de 5 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-300 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja 30G, 25 mm hipodérmica </td><td> Burkard Mfg Co. Ltd. </td><td> PDE0005 </td><td></td></tr></tbody></table>

el insecto<em&gt; galleria mellonella</em&gt; como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

El estudio de la virulencia bacteriana a menudo requiere un modelo animal adecuado. Modelos de mamíferos de infección son costosos y pueden plantear cuestiones éticas. El uso de insectos como modelos de infección proporciona una alternativa valiosa. En comparación con otros anfitriones modelo no vertebrados tales como los nematodos, insectos tienen un sistema relativamente avanzado de defensas antimicrobianas y por tanto son más propensos a producir información relevante para el proceso de infección de mamífero. Al igual que los mamíferos, los insectos poseen un complejo sistema inmune innato 1. Las células en la hemolinfa son capaces de fagocitar o encapsular los invasores microbianos, y las respuestas humorales incluyen la producción inducible de los péptidos antibacterianos de lisozima y 2,3 pequeño. Además, las analogías se encuentran entre las células epiteliales del intestino medio de larvas de insectos y células intestinales de los sistemas digestivos de mamíferos. Finalmente, varios componentes básicos esenciales para el proceso de infección bacteriana, como la adhesión celular, la resistencia apéptidos antimicrobianos, la degradación del tejido y la adaptación al estrés oxidativo es probable que sean importantes tanto en los insectos y mamíferos 1. Así, los insectos son herramientas polivalentes para la identificación y caracterización de factores de virulencia microbianos implicados en las infecciones de mamíferos. Las larvas de la polilla mayor de la cera Galleria mellonella se ha demostrado que proporcionan una información útil sobre la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas, incluyendo hongos de mamífero (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) y los patógenos bacterianos, tales como Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes o Enterococcus faecalis 4-7. Independientemente de las especies bacterianas, los resultados obtenidos con larvas de Galleria infectados por inyección directa a través de la cutícula se correlaciona necesariamente con los de Similar estudios de mamíferos: las cepas bacterianas que son atenuados en modelos de mamíferos demostrar menor virulencia en Galleria, y las cepas que causan graves infecciones humanas son también altamente virulento en el modelo Galleria 8-11. Infección oral de la Galleria es mucho menos utilizado y otros compuestos, como toxinas específicas, son necesarios para llegar a la mortalidad. G. mellonella larvas presentes varias ventajas técnicas: son relativamente grandes (larvas de último estadio antes de la pupación son aproximadamente 2 cm de largo y mg de peso 250), lo que permite la inyección de dosis definidas de bacterias, ya que pueden ser criados a diversas temperaturas (20 ° estudios C a 30 ° C) y la infección puede llevarse a cabo entre 15 ° C a 37 ° C por encima de 12,13, lo que permite experimentos que imitan un entorno de mamífero. Además, la cría de insectos es fácil y relativamente barato. La infección de las larvas permite monitorizar la virulencia bacteriana por varios medios, including cálculo de LD 50 14, la medición de la supervivencia bacteriana 15,16 y el examen del proceso de infección 17. Aquí se describe la cría de los insectos, que cubre todas las etapas de vida de G. mellonella. Proporcionamos un protocolo detallado de la infección por dos vías de inoculación: haemocoelic intravaginal. El modelo bacteriano utilizado en este protocolo es Bacillus cereus, un patógeno Gram positivo implicado en gastrointestinal, así como en otras infecciones oportunistas graves local o sistémica 18,19.

Inyección Intra haemocoelic de bacterias en G. mellonella ha demostrado ser muy útil para la identificación de factores de virulencia que se ocupan de los daños y la resistencia a los factores inmunes innatas de varios patógenos humanos. Como ejemplo, la figura 2A representa mortalidad de los insectos después de la inyección de varias dosis de B. bacterias cereus (tipo salvaje y cepas mutantes) 22. Figura 2B representa la supervivencia bacteriana de...

Haemocolic infección intra oral y de las larvas de la polilla mayor de la cera<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Se describe. Este insecto puede ser usado para estudiar los factores de virulencia de entomopatógeno así como mamíferos bacterias oportunistas. La cría de los insectos, los métodos de infección y ejemplos de<em&gt; In vivo</em&gt; Análisis se describen.

El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

El estudio de la virulencia bacteriana requiere a menudo un modelo animal adecuado. Los modelos de infección en mamíferos son costosos y pueden plantear cuestiones éticas. El uso de...

El objetivo general de este procedimiento es infectar las larvas de insecto Galleria mellonella con bacterias patógenas. Para ello, se llevan las larvas de insecto al estadio de crecimiento adecuado y se prepara una solución bacteriana. Luego, la larva se infecta con las bacterias mediante inyección intra-hemocélica o alimentación forzada. La mortalidad larval se monitorea entonces durante un período de 48 horas.El análisis de los datos obtenidos describe la virulencia bacteriana en un modelo de infección con insectos. Los insectos presentan la ventaja de tener un sistema avanzado de defensas antimicrobianas, y en particular, poseen un sistema inmunitario innato complejo, lo que permite evitar los costos y problemas éticos que podrían surgir al utilizar modelos de mamíferos. Los insectos constituyen un excelente modelo alternativo para el estudio de infecciones en mamíferos.Trabajamos con las larvas de la polilla de la cera mayor G me, que son relativamente grandes y pueden utilizarse para estudios de infección realizados entre 15 y más de 37 grados. Para imitar un entorno mamífero, Carina NI demostrará el procedimiento de cría, y Elizabeth GME y Christophe Beon demostrarán los pro

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección por Mycobacterium bovis en las larvas de la polilla de la cera mayor, Galleria mellonella. Se inyecta una cepa bioluminiscente de Mycobacterium bovis BCG en la hemolinfa de la larva para establecer la infección, y la bioluminiscencia se mide a intervalos predefinidos para estudiar el progreso de la infección.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en larvas de insectos

La larva de la polilla de la cera Galleria mellonella se creó recientemente como un modelo in vivo para estudiar la infección por Legionella pneumophila. Este sentido, demostrar las técnicas fundamentales para caracterizar la patogénesis de la Legionella en las larvas, incluyendo la inoculación, la medición de la virulencia bacteriana y la replicación, así como la extracción y el análisis de hemocitos infectados.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Galleria mellonella sirve como un modelo de invertebrado para la candidiasis diseminada. Aquí detallamos la infección el protocolo y proporcionar datos de apoyo para la efectividad del modelo.

El modelo de infección de Waxworm Galleria mellonella para la Candidiasis diseminada

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para un modelo de administración oral con larvas de Galleria mellonella y cómo caracterizar inducido la respuesta inmune innata. Mediante este protocolo, investigadores sin experiencia práctica será capaces de usar la g. mellonella forzada método.

Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced

Galleria mellonella se estableció recientemente como un modelo de infección reproducible, barato y éticamente aceptable para el complejo Mycobacterium tuberculosis. Aquí describimos y demostramos los pasos dados para establecer una infección exitosa de G. mellonella con Bioluminiscente Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Este estudio presenta un marco estandarizado para optimizar los modelos de infección por G. mellonella para su uso en la evaluación preclínica de antimicrobianos. La aplicación de un modelo de G. mellonella como parte de una línea de desarrollo preclínico de antimicrobianos podría disminuir el número de compuestos ineficaces que avanzan a los ensayos clínicos.

Galleria mellonella como modelo de cribado antimicrobiano

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Métodos para obtener imágenes de bioluminiscencia de las infecciones bacterianas en los animales vivos se describen. Los patógenos son modificadas para expresar luciferasa permitiendo imágenes ópticas de todo el cuerpo de las infecciones en los animales vivos. Los modelos animales pueden ser infectados con agentes patógenos que expresan luciferasa y el curso de la enfermedad como resultado visualizado en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia.

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Durante el proceso de infección, un paso clave es la adhesión de los patógenos con las células huésped. En la mayoría de los casos este paso la adhesión se produce en presencia de la tensión mecánica generada por el flujo de líquidos. Se describe una técnica que presenta el esfuerzo cortante como un parámetro importante en el estudio de la adhesión bacteriana.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

Aprende a infectar larvas de Galleria mellonella con bacterias patógenas mediante inyección intrahemocélica o alimentación forzada. Este modelo alternativo permite estudiar la virulencia bacteriana y las interacciones huésped-patógeno sin problemas éticos.

El insecto

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