A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de Cotiledones Arabidopsis Epidermis durante la germinación

El objetivo del siguiente experimento es visualizar los eventos tempranos del desarrollo epidérmico después de la germinación de las semillas a nivel celular. Esto se logra retirando primero la cubierta de la semilla para permitir una visión clara de la kosina como segundo paso. Las kosinas se montan bajo una capa de medio de agar que las inmoviliza y apoya su desarrollo a continuación. Se realizan imágenes de lapso de tiempo durante varios días para observar el crecimiento y la división de las células epidérmicas in vivo.

Se obtuvieron resultados que muestran expresión génica dinámica y localización de proteínas basada en fluorescencia visible. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las imágenes fijas de la tinción de Gus o las fusiones de GFP, es que muestra el movimiento dinámico de las proteínas durante la división y diferenciación celular. Las semillas de Arabidopsis para este experimento se esterilizan en una solución de esterilización de semillas hecha de 33% de lejía doméstica y 0,1% de Triton X 100, colocan semillas que llevan las construcciones y genotipos fluorescentes deseados en un tubo de 1,7 mililitros y se aplica un mililitro de solución de esterilización, se incuban en un mutador durante 15 minutos.

En una campana estéril, use una pipeta para eliminar la solución de esterilización del tubo, dejando las semillas. Enjuague con un mililitro de agua estéril. Repita cuatro veces después del cuarto enjuague.

Incubar a cuatro grados centígrados durante dos o más días. Para preparar el medio portaobjetos de la cámara, mezcle 20 mililitros de solución al 0,5% de bact a agar en agua en un matraz de 200 mililitros y cocine en el microondas hasta que se disuelva. Tenga cuidado al hervir la solución.

Llame a la solución a alrededor de 60 grados centígrados. Una solución demasiado caliente o aplicada demasiado rápido puede derretir el pegamento o agrietar el vidrio del portaobjetos de la cámara. Cuando la solución de agar esté lo suficientemente fría, recoja un mililitro con una pipeta y aplíquelo lentamente en el cubreobjetos dentro de la cámara de protección inmediatamente.

Añade un segundo mililitro de solución de agar. Los medios de agar ahora deberían cubrir completamente la parte inferior del portaobjetos de la cámara. Este medio mínimo es suficiente para apoyar el desarrollo de una planta de oleína, que contiene nutrientes almacenados durante cuatro o cinco días al mantener la humedad y permitir la difusión del gas.

Llame a la corredera con la cámara cubierta en la mesa de trabajo. Para comenzar este procedimiento, retire el tubo de semillas estériles del almacenamiento a cuatro grados centígrados. Coloque un pañuelo de papel en la platina de un microscopio de disección, humedézcalo con agua y ajústelo para crear una superficie lisa.

El tejido se utiliza para estabilizar las semillas durante la disección. Pipetear de 20 a 30 semillas del tubo sobre el tejido, teniendo cuidado de colocarlas en el campo de visión del telescopio de disección. La disección de la colead es el aspecto más desafiante de este procedimiento.

El uso de fórceps afiladas y de bajo aumento y el cuidado mucho ayudarán a garantizar una disección exitosa. Retire con cuidado la cubierta de la semilla de la plántula por dentro, se deben eliminar los tegumentos externos e internos. A continuación, utilice un bisturí para cortar el plomo de la cuna libre de hiper cotas y radicales.

Es beneficioso quitar el hiperco y el radical para la imagen porque si está intacto, el hiper cot se enderezará y alargará drásticamente. Moviendo el Koss Leadin fuera del campo de visión de lapso de tiempo, mantenga el cos leadin diseccionado sumergido en agua. Repita la disección de semillas hasta alcanzar el número deseado de Olean.

Se recomiendan de 15 a 20 disecciones exitosas antes de montar Olean en el portaobjetos de la cámara. Para preparar el portaobjetos de la cámara para el montaje del cotán, utilice un pequeño cubreobjetos para cortar el medio de agar y levantar toda la capa desde la base de vidrio de la cámara. Deslice la pipeta de cotán disecado con una cantidad mínima de agua desde el tubo de retención hacia la cámara.

Deslice por debajo de la capa de agar levantada. Baje suavemente el agar sobre las sedinas. Si hay exceso de agua, remojela con un pañuelo de papel.

Tenga cuidado de no molestar a los sedins cuando se complete el montaje. Los especímenes ya no deben moverse con facilidad. Coloque la tapa en el portaobjetos de la cámara y transfiera el portaobjetos a la platina del microscopio.

Antes de la obtención de imágenes, configure el microscopio confocal invertido para obtener imágenes del flúor deseado. Los parámetros del LSM 700 son para la excitación GFP de 488 nanómetros y la recolección. Con un filtro de paso de banda de 440 a 530 nanómetros y para excitación RFP de 555 nanómetros y recolección.

Con un filtro de paso de banda de 570 a 610 nanómetros con un objetivo de 20 veces. Concéntrese en la entrada ACO y mueva el objetivo al centro de la cámara. Deslice el dedo en el modo de adquisición, cambie el zoom a 0,5 y el tamaño del fotograma a 48 por 48 píxeles.

Seleccione la casilla de verificación posiciones y escanee la imagen general y, a continuación, aumente los números de mosaico horizontal y vertical de 30 a 35. Haga clic en el botón de escaneo para comenzar a escanear. Cuando se complete el escaneo, haga clic en el botón de posiciones debajo de la pestaña de dimensiones y coloque una cruz en cada punta de cuna para observar.

Inspeccione las muestras montadas en busca de daños. Elimine las posiciones correspondientes a la plomo coss dañada para dejar solo las muestras adecuadas para la obtención de imágenes. A continuación, configure una serie Z que abarque la epidermis principal de todas las muestras.

Haga clic en la casilla de verificación Zack. Seleccione cada posición en la lista de posiciones y haga clic en el botón Mover a. Concéntrese en el plano superior del cable cos en la epidermis y haga clic en el botón establecer primero debajo de Zack.

Concéntrese en la posición más baja en la que la epidermis sea útilmente visible. Y haga clic en el botón establecer el último. Haga clic en el botón junto a óptimo, que muestra el mejor grosor de corte Z para establecer.

Verifique cada entrada de kos para confirmar que estos ajustes abarcan todas las muestras. Los parámetros Z no se pueden establecer para posiciones individuales. En el software Zen 2009 utilizado aquí, las series temporales con la resolución deseada y los intervalos de longitud de 15 a 30 minutos durante tres días son efectivos para la dinámica de proteínas en la división celular epidérmica, pero los intervalos se pueden cambiar según sea necesario.

Haga clic en la casilla de verificación de series temporales en series temporales, establezca ciclos para el número de imágenes deseado escribiendo el campo de texto, establezca intervalo en 30 y utilice el menú desplegable para seleccionar MIN para comenzar XY, ZT, escaneo multiposición, cambiar el tamaño de fotograma a la resolución deseada y recopilar, iniciar experimento. Tenga en cuenta que el número de posiciones debe estar limitado por las especificaciones de escaneo. Si el tiempo total de escaneo es mayor que el intervalo deseado, los puntos de tiempo no serán correctos.

Con este sistema, es posible un máximo de seis posiciones simultáneas al obtener imágenes de GFP y RFP en cortes Z de 59 en un intervalo de 30 minutos. Aquí se muestra un ejemplo de un conjunto de puntos de tiempo informativos recopilados con este método. Las membranas celulares se marcan con RFP y GFP fusionadas con una proteína polar bajo su promotor nativo.

Las imágenes de la serie A muestran que la GFP polar aparece inicialmente distribuida uniformemente y luego aproximadamente dos horas antes de las divisiones asimétricas indicadas por puntas de flecha. La GFP polar se segrega lejos del sitio del OID meister incipiente en la serie B siguiendo la división asimétrica inicial indicada por la punta de flecha a las 47 horas. La GFP polar desaparece en ambas células.

Implicando una rápida transición al estado de célula madre protectora por el meris oide, la célula madre protectora indicada por el asterisco se divide simétricamente y se diferencia para formar células protectoras estomáticas, mientras que la célula cistocelular recupera la expresión polar de GFP presumiblemente precediendo a una división asimétrica posterior. Aquí se muestra un video registrado simplificado de la localización de GFP polar durante la amplificación y el espaciamiento de una célula precursora de estomas. Inicialmente, la GFP polar aparece uniformemente en la célula a las 39 horas después de la germinación.

Se polariza fuertemente justo antes de una división a las 40 horas, colocando a una criada más pequeña en el extremo opuesto de la celda. La célula más grande de la derecha también recupera la identidad del linaje estomatológico y, a las 45 horas, la localización de la GFP polar se desplaza adyacente al precursor estomático. La división a las 47 horas produce un nuevo esteroide a la derecha orientado lejos del estamoide me existente a la izquierda del primer me estamoide.

El resultado final es que dos estomas están separados por una celda. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el lapso de tiempo a largo plazo de una coleadina en germinación para evaluar la expresión génica y la localización de proteínas en la epidermis durante el desarrollo.