Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en Drosophila Los ovocitos

En este protocolo, los citos que expresan proteínas marcadas con GFP se diseccionan de Drosophila hembra y se obtienen imágenes para estudiar el movimiento de la proteína en células vivas. Primero, prepare una cámara de visualización fijando dos cubreobjetos a un portaobjetos con grasa de silicona para formar un canal. Los lados del canal están revestidos con aceite de carbono halo.

A continuación, disecciona los ovarios de una hembra en una gota de aceite de carbono de halo en un cubreobjetos. A continuación, aísle los cititos individuales e invierta el cubreobjetos sobre el canal en el portaobjetos preparado para crear una cámara de visualización. Después de localizar los citos con óptica de campo claro o DIC, capture imágenes digitales a intervalos de tiempo establecidos utilizando microscopía confocal y software asociado.

En última instancia, una secuencia de lapso de tiempo de las imágenes generadas se puede utilizar para monitorear el movimiento de proteínas o partículas en células vivas a lo largo del tiempo. Este método puede ayudar a investigar áreas clave de la biología celular y del desarrollo, como el tráfico de proteínas y ARNm, y el establecimiento de la polaridad celular. Primero anestesia a las moscas sanas que tienen menos de una semana de edad y seleccione de 10 a 15 hembras grandes con abdómenes redondeados de color crema.

Transfiera las moscas seleccionadas y algunos machos a un vial que contenga alimento nuevo con levadura ligera. Luego incubar las moscas durante dos días a 25 grados centígrados para que engordenen. El engorde de las moscas garantiza que una variedad de etapas, especialmente las etapas ocho a 12, estén disponibles para obtener imágenes de moscas sin engordar o moscas mal engordadas, por lo general, solo contienen etapas muy tempranas y citos maduros con grasa de silicona.

Coloque dos cubreobjetos de aproximadamente un centímetro de distancia en un portaobjetos de vidrio estándar. Utilice solo suficiente grasa para asegurar un buen sellado entre el deslizamiento de la cubierta y la corredera. Presione firmemente hacia abajo cada cubreobjetos para esparcir la grasa de manera fina y uniforme.

A continuación, añada un poco de aceite de carbono 27 a la unión entre los cubreobjetos y deslícelo para evitar dañar los citos aislados en los pasos posteriores. Ahora coloque dos o tres gotas de aceite de carbono 27 sobre la superficie de un cubreobjetos de 22 milímetros cuadrados. A continuación, pipetee una hembra individual del vial de alimento y se deposita suavemente en el halo de aceite de Caron.

Con pinzas de disección afiladas, sujeta la mosca contra el cubreobjetos y retira la punta del abdomen. Retire los ovarios arrastrándolos a lo largo de la superficie del cubreobjetos debajo del aceite para promover la adhesión de los citos al cubreobjetos. Ahora separe suavemente los ovarios en busca de citos que estén al menos en la etapa 10 B de la ovogénesis.

Identifique los ovocitos en esta etapa buscando cámaras de óvulos en las que el ovocito ocupe al menos del 50 al 60% del volumen total de la cámara de óvulos. Uso de fórceps. Extraer ovocitos individuales de la vaina ovial utilizando de una a tres hembras.

Continúe aislando de cinco a ocho ovocitos no dañados en el cubreobjetos. A continuación, retire cualquier tejido inutilizable. Invierta con cuidado el cubreobjetos que contiene los ovocitos en el portaobjetos preparado previamente para que los cititos queden colocados entre los dos espaciadores.

Y recuerde, no presione hacia abajo el cubreobjetos, ya que puede dañar los citis si es necesario, agregue una pequeña cantidad de aceite de carbono de halo a los bordes del sándwich para asegurarse de que el espacio esté lleno. Observe que en este punto de la ovogénesis, las células del folículo que recubren el ovocito se han vuelto más coerantes y rodean al ovocito por todos lados, excepto por una pequeña región donde permanecen las conexiones con las células nodrizas. Enfocar un ovocito mediante DIC o óptica de contraste de fase.

Examina el ovocito en busca de signos de daño, como fuga de citoplasma o protuberancia de las células del folículo. Tome imágenes solo de los ovocitos que parecen sanos y sin daños. Para supervisar el streaming directamente sin etiquetado GFP.

Establezca las imágenes de captura en el rango ZI del osciloscopio con ajustes de ganancia más altos que los utilizados para las proteínas marcadas con GFP. Usar objetivos aéreos para minimizar en gran medida la deriva y el movimiento de la muestra. Obtener secciones ópticas justo debajo de la superficie del ovocito.

Una vez que una región de interés esté enfocada, apague la óptica de campo claro y cambie a imágenes confocales utilizando la función de vista previa de escaneo rápido del software, ajuste el enfoque y la ganancia según sea necesario. Además, establezca los parámetros de excitación, longitud de onda y una longitud de onda de emisión. Para la captura del eje Z, seleccione un eje Z constante con un retraso de 10 segundos entre fotogramas.

Después de capturar una secuencia típica de lapso de tiempo de entre 20 y 50 fotogramas, revise y evalúe inmediatamente la calidad del video. Esta imagen de lapso de tiempo muestra un ovocito en etapa 11. Este ovocito que expresa la proteína R TNL uno marcada con GFP puede producir una señal fuerte.

R TNL uno parece colocalizarse con los microtúbulos largos presentes durante el flujo opplásmico. Típicamente, el flujo opplásmico en una cámara de huevos de tipo salvaje es evidente como un movimiento notable de vesículas de ylk autofluorescentes, como se muestra en una proyección máxima de cinco fotogramas de una cámara de huevos de etapa 10 B. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar citos femeninos sanos que expresan proteínas marcadas con GFP, cómo preparar muestras para imágenes en vivo y cómo tomar videos de lapso de tiempo de proteínas y partículas fluorescentes.