Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar fibras vivas individuales y sus células madre asociadas a partir del músculo EDL de ratones adultos. Esto se logra diseccionando primero la EDL utilizando un procedimiento de disección de tendón a tendón que no daña las fibras. A continuación, se realiza una digestión muscular para desagregar las fibras mientras se preserva la asociación de células madre miofibras, que es un paso único de este protocolo.

En el paso final, las fibras myo individuales se separan suavemente entre sí, mientras que los residuos o las fibras hipercontraídas se eliminan mediante lavados secuenciales. En última instancia, las fibras miométricas aisladas por esta técnica pueden mantenerse en un estado semi-quiescente con estímulos de activación mínimos o cultivarse en un medio de alta suero para el estudio de la activación y diferenciación de las células satélite. En los últimos años, el uso de fibras de turbera cultivadas ha sido un enfoque muy poderoso para estudiar la activación, proliferación y diferenciación de células satélite en un nicho fisiológico relevante.

Este enfoque realmente nos ha permitido hacer grandes avances en la comprensión de la función de estas células a nivel molecular y celular. Para cada ratón del que se aísla EDL, prepare cinco placas de Petri de plástico de 60 milímetros con una capa de pipeta de suero de caballo, cuatro milímetros de suero de caballo en un plato y gírelo para obtener un recubrimiento uniforme. A continuación, retira el suero de caballo aspirando los restos de suero, y deja secar el plato durante al menos 30 minutos.

Después de media hora, agregue cuatro mililitros de medios de lavado a cuatro platos. Etiquete los platos de la siguiente manera, músculo después de la digestión, lave uno, lave dos y lave tres. Agregue cuatro mililitros de medio de cultivo de fibra al plato de cultivo de fibra restante.

Mantenga los platos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% antes de usarlos. A continuación, para el aislamiento de una fibra, prepare dos pipetas estériles bajo un microscopio. Haga una pipeta de gran diámetro cortando una pipeta de pequeño diámetro con un bolígrafo de diamante para que la abertura sea lo suficientemente grande como para que todo el músculo pueda pasar a través de ella.

La segunda pipeta es una pipeta de diámetro pequeño para la manipulación MyFi. A continuación, flamee las pipetas para suavizar los bordes y para la esterilización utilizando la curva de llama, la punta de la pipeta de diámetro pequeño. Esto ayudará a manejar fibras individuales durante el aislamiento.

A continuación, reboce ambas pipetas con suero de caballo. Por último, asegúrese de limpiar la estación del microscopio y las herramientas de disección con etanol al 70%. Para esta demostración, se utilizaron ratones transgénicos SV 1 29 de ocho semanas de edad.

Fueron sacrificados. Rocíe las extremidades traseras con etanol al 70%. A continuación, sujeta al animal a una tabla de soporte boca arriba.

Esto es necesario para proporcionar un mejor agarre de las extremidades traseras. A continuación, corte toda la longitud de la extremidad y exponga el músculo subyacente. Retira la piel, así como el pelo o el pelaje.

Con unas tijeras finas, corte a través de la fascia delgada que rodea el músculo sin dañar el tejido subyacente. Exponga los tendones distales TA y EDL con Cohan Vana afilado. Tijeras de resorte.

Corte los tendones distales EDL y TA. A continuación, con la ayuda de fórceps, sujete los músculos TA y EDL por sus tendones y tire delicadamente de los músculos hacia el extremo proximal. En este punto, debería poder ver claramente el músculo EDL justo debajo del músculo TA.

Ahora separe el EDL del músculo TA tirando de los dos tendones en direcciones opuestas. Evite estirar el músculo EDL mientras realiza esta operación. Ya que esto dañará las fibras mio.

Exponga el tendón EDL. En este punto, puede ser útil extirpar el músculo TA para visualizar mejor el tendón proximal. También puede ser útil cortar parte del tejido conectivo alrededor de la rodilla.

Una vez que el tendón esté claramente visible, use unas tijeras afiladas de cohan Venus Spring para liberar el músculo EDL. Si el procedimiento se ha realizado correctamente, si el EDL debe ser capaz de mantener su forma alargada, una vez retirado de la extremidad, sosteniendo el músculo EDL a través de sus tendones, transfiéralo a una solución precalentada de colagenasa de dos mililitros e incube en un baño de agua a 37 grados Celsius. Repita el proceso para aislar la segunda EDL y transferirla al mismo tubo de colagenasa para una digestión desigual.

El aislamiento de la segunda EDL debe completarse dentro de los cinco minutos posteriores al aislamiento. Es posible que sea necesario ajustar el primer tiempo de incubación de EDL en función de la actividad colágena, el tamaño del músculo, la edad del animal o la condición muscular. Por ejemplo, el músculo con mucho tejido fibrótico puede requerir un tiempo de incubación más largo.

Además, tenga en cuenta que se ha demostrado que la agitación durante este tiempo activa las células S Durante el tiempo de digestión, revise regularmente el músculo para evitar la digestión excesiva. Detenga la digestión cuando los músculos comiencen a aflojarse y las fibras miométricas se vuelvan visibles. Con la pipeta de gran diámetro, transfiera con cuidado ambos músculos a una placa de Petri precalentada.

Con cuatro mililitros de medios de lavado se debe evitar la digestión excesiva, ya que da como resultado fibras miométricas hipercontraídas. Para liberar las fibras miométricas, use la pipeta de vidrios de gran diámetro para enjuagar el músculo con medio tibio hasta que las fibras comiencen a liberarse naturalmente. No tritrate el músculo, ya que esto inevitablemente resultará en fibras dañinas.

Continúe liberando las fibras mio hasta alcanzar el número deseado. No deje el plato a temperatura ambiente durante más de 10 minutos. Devuélvalo a la incubadora durante cinco minutos para que se reequilibre antes de seguir trabajando con él.

El cultivo actualmente contiene una mezcla de fibras individuales vivas, que son estructuras tubulares largas y brillantes, fibras hipercontraídas, que son oscuras y cortas y desechos. Ahora, con la pipeta de diámetro pequeño, transfiera las fibras MYOP individuales vivas a una nueva placa predesparasitada. Maneja cada fibra myop individualmente.

En lugar de transferir la mayor parte de las fibras miométricas de una sola vez, si es necesario, regrese el plato a una incubadora durante 10 a 15 minutos para reequilibrar el medio. Transfiera las fibras myop individuales dos veces más para eliminar todas las fibras myo muertas y los desechos al final de al menos tres lavados consecutivos. Solo las fibras vivas individuales de mio deben permanecer en el plato para el cultivo o el análisis posterior.

Las fibras vivas tienen una morfología larga. Por el contrario, las fibras hipercontraídas son más cortas y gruesas. Ahora, incube las fibras miométricas aisladas en un medio de lavado durante al menos una hora antes de cambiar al medio de cultivo.

En una nueva placa de precalentamiento, el medio alto permitirá la activación de células satélite para cultivos largos. Matrigel podría ser apropiado independientemente del medio elegido. Cámbielo cada dos días en el momento del aislamiento.

Las células satélite de cada MyFi aparecen como diminutas protuberancias en la superficie de la miofibra cuando se observan con un microscopio óptico. Si las fibras miométricas se mantienen en un medio rico en suero durante períodos prolongados de tiempo, se observan predominantemente tubos miométricos completamente diferenciados en el cultivo. Las cepas de ratones reporteros, como la línea MIFF five Cree Rosa YFP, son herramientas óptimas para estudiar el proceso de regeneración muscular.

Los tubos Myo derivados de un cultivo de fibra Miff five Cree Rosa YFP expresaron el MIFF five reporter YFP. Esto sugiere que la regeneración muscular requiere la activación de Miff cinco. La cepa de ratón tomate PAX seven Cree TD es otra línea reportera.

La señal de fluorescencia del tomate TD solo es detectada por células satélite, mientras que los núcleos myON son claramente negativos. Esto sugiere que el factor de transcripción PAX siete se expresa de forma única por las células madre musculares y no por su progenie diferenciada. Las fibras miométricas y sus células satélite asociadas se pueden fijar aguas abajo.

Inmunofluorescencia Las células satélite positivas para pyo D siete células satélite positivas para myo D se consideran clásicamente progenitores musculares comprometidos proliferativos. Completarán el programa de diferenciación mediante la REGULACIÓN NEGATIVA de PAC siete mientras mantengo mi expresión de OD o volverán a la quietud regulando a la baja mi DO y manteniendo la expresión de PAC siete. La técnica de aislamiento de fibra única tiene la característica única de preservar la asociación fisiológica de células satélite de miofibra.

El paso más crítico de este procedimiento es la disección del músculo EDL de tendón a tendón. La manipulación mínima de la fibra también permite la preservación de la integridad y viabilidad de la fibra. El aislamiento exitoso de fibras individuales de miope depende de varios factores, como la actividad colágena, la condición muscular o la edad.

Lo más importante es que el aislamiento del músculo de tendón a tendón permite mantener la integridad de la fibra. Además, la manipulación mínima de las fibras durante todo el procedimiento permite una mayor tasa de supervivencia.