Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133 + Putativos células madre del cáncer de melanoma

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos de células derivadas de pacientes a partir de melanomas malignos y aislar células madre cancerosas positivas para CD 1 33 putativas. Esto se logra preparando primero células individuales de melanoma primario a partir de un tejido tumoral después de agotar los eritrocitos de la célula granulada. Si es necesario, caracterice el cultivo celular primario y agote los fibroblastos.

El paso final es realizar la clasificación magnética de las células de melanoma CD 1 33 positivas y CD 1 33 negativas. En última instancia, este procedimiento máximo optimizado es un método excelente para obtener poblaciones altamente enriquecidas y viables de células CD 1 33 positivas y CD 1 33 negativas. Primero utilizamos la técnica para validar los datos de insco en medicina personalizada, donde tratamos de predecir la respuesta a los medicamentos de los pacientes con cáncer y para eso no se puede utilizar ninguna línea celular disponible comercialmente.

La principal ventaja de la técnica es que tenemos un acceso rápido a las células CD 1 33 positivas, que son células madre cancerosas putativas en el melanoma maligno. La técnica será presentada por Catherine Davis, una técnica de laboratorio de mi laboratorio. Transfiera el tejido tumoral recién aislado de la cirugía al laboratorio de cultivo de tejidos en PBS estéril que contenga estreptomicina al 1 %.

Transfiera el tejido tumoral a una placa de Petri estéril, aspire el exceso de solución. Luego agregue 500 microlitros de mezcla de disociación y pique el tumor en trozos pequeños de dos a cuatro milímetros con bisturíes estériles frescos. Ahora transfiera de dos a cuatro gramos de tejido tumoral picado a un tubo suave de C máximo que contenga una mezcla de disociación de cinco mililitros.

Enjuague la placa de Petri con una mezcla de disociación adicional de 4,5 mililitros y agregue los fragmentos de tejido restantes al tubo suave de C máximo. Cierre el tubo, conéctelo boca abajo sobre el manguito de la disociación y ejecute el programa H tumor cero uno. A continuación, incube la muestra durante 30 minutos a 37 grados centígrados en rotación continua a la velocidad de ejecución más alta.

Ahora coloque el tubo boca abajo en el manguito de la disociación y ejecute el programa H tumor cero dos. Luego incube la muestra durante 30 minutos a 37 grados centígrados bajo rotación continua a 12 RPM. A continuación, ejecute el programa de máx. H tumor cero tres.

Vuelva a suspender la muestra y pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micras a un tubo de 50 mililitros. Si es necesario, agite la suspensión celular con una punta de filtro estéril hasta que la suspensión completa se agote. Enjuague el filtro de células con cinco mililitros de pellet medio quantum 2 6 3 de la suspensión de células durante cinco minutos a 300 G y deseche el sobrenadante.

Si la célula palda parece leída debido a una gran cantidad de tices y mentiras, glóbulos rojos como se detalla en el protocolo de texto complementario. Vuelva a girar las células tumorales en el quantum 2 6 3 y siembre un cultivo que pase las células de forma rutinaria cuando alcancen el 80% de confluencia. Analice el cultivo celular primario fenotípicamente usando un microscopio.

A continuación, recoja una pequeña cantidad del cultivo celular primario para la extracción de ARN tras la síntesis de CD NA y realice R-T-P-C-R con cebadores para melanoma neoplásico, células madre y genes marcadores de células del estroma. Los genes más importantes a analizar son el marcador de fibroblastos CD 90, el marcador de melanoma y melanocitos desgarrado, el marcador de células madre cancerosas CD 1 33, el marcador de células dendríticas maduras, CD 83, y un gen de mantenimiento como HPRT o GAAP dh. Si el análisis microscópico combinado y R-T-P-C-R reveló una alta contaminación por fibroblastos del cultivo primario de melanoma, proceda a agotar los fibroblastos utilizando las columnas de antifibroblastos, microperlas y LD.

Lave el 80% de las células de confluencia con PBS precalentado, agregue la cantidad adecuada de Accutane e incube hasta que las células se desprendan de la superficie de cultivo. Recoja las células en medio cuántico 2 6 3 y transfiéralas a un tubo de 50 mililitros. Enumere las celdas y luego centrifugue el número requerido de celdas durante cinco minutos a 300 G y de cuatro a ocho grados Celsius.

Aspirar el sobrenadante completamente y resus. Suspenda hasta una vez 10 a la octava celda en tampón de 350 microlitros máx., agregue 100 microlitros de reactivo de bloqueo FCR y 50 microlitros CD 1 33. Una biotina.

Mezclar bien e incubar a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Lave las células con tampón de 10 mililitros como máximo, seguido de una centrifugación durante cinco minutos a 300 g y de cuatro a ocho grados centígrados. Aspire el sobrenadante por completo después de un segundo lavado.

Vuelva a suspender el pellet de celda en 400 microlitros de tampón máximo. Agregue 100 microlitros de microesferas anti biotina y mezcle bien incubar a cuatro a ocho grados centígrados durante 15 minutos. Mientras tanto, para preparar el separador max para la separación magnética, conecte el quadro max al soporte multis del separador max.

Inserte el número requerido de columnas LS con las alas de la columna al frente en el campo magnético del quadro max. Coloque un filtro de separación de pres en cada columna LS y un tubo de recolección adecuado. Debajo de cada columna, enjuague el filtro y la columna con un tampón de tres mililitros como máximo y deseche el flujo.

Después de lavar las células en tampón máximo como se describió anteriormente, vuelva a suspender las células en tampón máximo de 500 microlitros y aplique la suspensión celular en su columna LS preparada. Lavar tres veces con un tampón de tres mililitros como máximo por columna. Recoja el afluente total de la fracción de células negativas cd 1 33 sin etiquetar.

A continuación, deseche el filtro de separación de pres. Retire la columna del separador y colóquela en un tubo de recolección adecuado. Aplica un tampón de cinco mililitros como máximo.

Enjuague inmediatamente las células positivas CD 1 33 marcadas empujando firmemente el émbolo en la columna para aumentar la pureza de la fracción negativa. Aplique la suspensión de la celda sobre una nueva columna LS equilibrada y recoja la fracción negativa del efluente CD 1 33. Esta metástasis ganglionar resecada se obtuvo de un paciente con melanoma en estadio tardío.

Después de la disociación mecánica y enzimática del tejido, el pellet de células filtradas contenía una alta contaminación con eritrocitos. Posteriormente, el agotamiento de los glóbulos rojos dio como resultado una bolita celular de color marrón claro. Estas células se cultivaron en medio cuántico 2 6 3 aquí, un R-T-P-C-R de melanocitos y melanoma, fibroblastos, dendríticos y marcadores de células madre.

Los genes se utilizan para verificar que las células se originaron a partir del tumor y no del estroma circundante. Los melanocitos adultos sirvieron como células de control normales para el desgarro y la línea celular de carcinoma embrionario N-C-C-I-T como control positivo para el marcador de células madre CD 1 33. Estos datos revelan que algunas células primarias son efectivamente positivas para el desgarro y, por lo tanto, de origen melanocítico.

El cultivo también es negativo para CD 83, el marcador de las células dendríticas maduras. Curiosamente, esta línea celular de melanoma expresa CD 1 33, un gen crucial para la división celular asimétrica y un marcador conocido de células madre cancerosas. Aquí se muestra una micrografía de campo claro de un cultivo celular primario altamente contaminado con fibroblastos después del tratamiento para el agotamiento de fibroblastos, los cultivos representan células primarias de melanoma.

Las células primarias de melanoma se clasificaron en células CD 1 33 positivas y CD 1 33 negativas. Estos datos de inmunofluorescencia, tinción y análisis de Western blot indican una alta eficacia y pureza de clasificación. El enfoque tiene grandes implicaciones para la medicina personalizada porque ahora podemos utilizar tejidos y células derivados de pacientes para predecir mejor la respuesta a los medicamentos de cada paciente individualmente.

Este método nos ayudará a responder preguntas clave como, ¿de dónde deriva el tumor? ¿Cómo se puede tratar a los pacientes? Y ayudará a redefinir mejor los enfoques de la biología de sistemas mediante la validación de sus experimentos.