Osmótica Drug Delivery de miembros posteriores isquémicos y la perfusión de la vasculatura con Microfil para Micro-tomografía computarizada

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la inserción in vivo de una bomba osmótica para la administración de sustancia local a las extremidades posteriores isquémicas de ratones y la posterior perfusión de la vasculatura de las extremidades posteriores con microrelleno para la obtención de imágenes de microtomografía computarizada. Esto se logra haciendo primero una incisión en el hombro y la extremidad trasera del animal de experimentación para permitir el túnel de los tubos de la vaina a lo largo del interior de la espalda del animal. En el segundo paso, se inserta una bomba osmótica llena y cebada y un catéter a través del tubo y la bomba se sutura en la espalda del animal.

A continuación, se retira el tubo. La arteria femoral está doblemente ligada proximal a la bifurcación femoral y se sutura la incisión. Posteriormente, la vasculatura posterior se perfunde con microfill, un agente de imagen de silicona a través del catéter infrarrenal de la aorta abdominal.

En última instancia, se puede obtener una imagen en 3D del molde vascular de la extremidad posterior isquémica del ratón que se hace visible con microrelleno. Soy el Dr. Richard Dixon, jefe de los Laboratorios de Investigación de Cardiología Molecular del Instituto del Corazón de Texas. Nuestro laboratorio ha estado desarrollando una variedad de terapias celulares y farmacológicas para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y enfermedades vasculares periféricas.

Uno de los modelos más comunes para probar compuestos en la enfermedad vascular periférica es el modelo de isquemia de las extremidades traseras de los roedores animales. Recientemente hemos desarrollado una serie de avances importantes en este modelo, y nos gustaría presentárselos en este vídeo de presentación. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente como las inyecciones diarias de medicamentos, es que esta técnica reduce las necesidades de manejo del animal y el seguro.

La administración local continuada de una sustancia durante el período de inicio. Además, las imágenes por micro TC de los vasos moldeados con microrelleno son ventajosas sobre las imágenes histológicas o de profusión con láser dopper debido a la capacidad de la micro TC para realizar un análisis tridimensional verdaderamente cuantitativo y volumétrico que es representativo de la vascularización a lo largo de toda una muestra. Usando la técnica estéril, comience pesando la bomba vacía y registrando su peso en miligramos.

A continuación, use una jeringa CC y un tubo de llenado de calibre 27 con punta roma para llenar la bomba lentamente con PBS. Cuando el PBS llegue a la parte superior de la bomba, deje de llenar. Después de limpiar el exceso de solución, pese la bomba llena.

Luego use un par de pinzas para separar el reborde blanco del flujo. El moderador debe tener cuidado de no doblar o aplastar la cubierta del tubo de tres a cuatro milímetros de cualquiera de los extremos del moderador con un catéter P 50. Ahora use una jeringa para llenar el catéter y el moderador dejando la jeringa unida a la parte distal del catéter.

Comience a insertar el moderador de flujo en la bomba. Cuando el catéter esté al ras de la superficie de la bomba, retire la jeringa del catéter e incube la bomba en PBS a 37 grados centígrados durante la noche. El día de la cirugía, aplique ungüento para los ojos en un ratón prono completamente sedado y luego coloque un cono de nariz ajustado que administre un flujo continuo de isof flúor sobre el animal. Después de inyectar anestésico en el sitio de la incisión, trate la piel con una solución de povidona yodada seguida de etanol al 70%.

Luego haga una incisión de cuatro a seis milímetros en la región de la escápula al costado de la columna vertebral. Utilice pinzas finas para separar la membrana subcutánea. Luego, después de girar el ratón a la posición supina, use tijeras microquirúrgicas para hacer una incisión de 0,8 a un centímetro por encima de la rodilla hacia el muslo medial siguiendo el camino de la arteria femoral.

Luego, use un pequeño tubo de vaina para hacer un túnel por el costado del torso desde la parte medial del muslo hasta la incisión en la espalda. A continuación, después de devolver el ratón a la posición prona, guíe el catéter de la bomba osmótica principal a través del tubo de la vaina hasta el muslo y, a continuación, coloque la bomba dentro de la espalda del animal. Cierre la incisión posterior con una sutura de seis prolene.

Después de colocar el ratón en posición supina, una vez más, retire el tubo de la vaina, dejando el catéter expuesto a través de la incisión en el muslo. Asegure la pierna con cinta quirúrgica. A continuación, utilice un retractor para abrir la incisión y separar el tejido graso subcutáneo para revelar la vasculatura.

A continuación, utilice pinzas finas y puntiagudas para perforar suavemente la vaina femoral membranosa. Para acceder al haz vascular sin causar sangrado excesivo. Diseccione y separe cuidadosamente la arteria femoral de la vena femoral y el nervio cerca de la ingle.

A continuación, coloque dos suturas adyacentes de ocho oh prolene para interrumpir la arteria femoral, de dos a tres milímetros proximales a la bifurcación femoral en el origen de las RMF profundas y las arterias epigástricas. Ahora corte el catéter a la longitud adecuada. Coloque la punta en la región anterolateral del muslo y asegure la punta con una sutura de prolene 6.0 a la fascia superficial.

Para prepararse para la toma de imágenes, coloque al ratón anestesiado en posición supina e inyecte 0,2 cc de 1000 UI de heparina sódica por vía subcutánea para evitar la coagulación en la vasculatura del animal mientras el ratón está unido al cono de la nariz. Haga una incisión lo suficientemente grande como para exponer la cavidad torácica y la parte inferior del abdomen después de mover los órganos abdominales al lado izquierdo del animal. Para exponer la aorta abdominal infrarrenal, separe cuidadosamente la aorta de la vena cava inferior.

A continuación, ligar la aorta abdominal infrarrenal proximal y utilizar la punta de la aguja para hacer una pequeña incisión en el vaso. A continuación, inserte una aguja roma de calibre 27 y medio conectada a un catéter P 10 en la aorta abdominal infrarrenal y asegure la aguja con una sutura de seis oh. Después de asegurar la aguja de calibre 27 y medio, haga una incisión en la aurícula derecha y administre una sobredosis de isof flúor para inducir la eutanasia y permitir la salida del exceso de líquido.

Ahora, coloque una jeringa de 20 cc llena de solución salina heparinizada en la punta de la aguja y enjuague la vasculatura durante al menos cinco minutos. Retirar el cono de la nariz una vez que comienza el lavado, la inyección del microfill es el paso más difícil del procedimiento. Para asegurar el éxito, es importante asegurarse de que toda la sangre se enjuague de los vasos después de la perfusión con vela, ahora conecte una jeringa de 20 cc llena de formalina al catéter y presione el recipiente durante cinco minutos adicionales.

Finalmente, perfunde lentamente el recipiente con el microrelleno durante cinco minutos. Tenga cuidado de aplicar una presión constante al administrar el microrelleno para lograr una fundición óptima del recipiente. Opcionalmente, en este punto, la piel se puede diseccionar para ver la vasculatura llena de microrelleno para un análisis posterior de la cara.

Para la polimerización del agente de contraste, coloque el animal en un recipiente lleno de NBF al 10% y guárdelo a cuatro grados centígrados después de 24 horas. Use herramientas de disección para extirpar la piel distal a la aorta abdominal inferior. Refresque el NBF y vuelva a colocar el animal en el recipiente a temperatura ambiente.

A los cuatro días, diseccionar las extremidades posteriores contralaterales e isquémicas para facilitar la descalcificación ósea. Coloque las muestras en una solución de ácido fórmico durante 48 horas y luego enjuague las muestras con agua corriente durante una hora. Finalmente, devuelva las muestras a 10% de NBF y proceda con imágenes de tomografía computarizada y micro computarizada.

Esta primera figura muestra imágenes representativas de láser Doppler de la perfusión sanguínea antes y la ligadura quirúrgica de la arteria femoral. En la extremidad posterior del ratón, se creó isquemia en la extremidad posterior izquierda como lo indican las flechas después del yeso vascular con microrelleno, una imagen de tomografía microcomputarizada en 3D de la red vascular muestra que el microrelleno puede llenar los vasos de manera efectiva. Sin embargo, pueden ocurrir discontinuidades debido a diversos factores de procedimiento, como burbujas de aire, falta de presión o la viscosidad del microrelleno, los puntos de discontinuidad se indican con las flechas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar una bomba asmática para administrar una sustancia de manera estable a la extremidad trasera de un ratón después de una cirugía de isquemia.