Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células ASIN pancreáticas primarias y mantenerlas in vitro. Esto se logra extrayendo primero el páncreas de la casa del ratón. A continuación, los asinina pancreática se disocian mediante una haasa enzimática moderada en una digestión.

A continuación, los asinina pancreáticos se disocian mecánicamente mediante pipeteos sucesivos. Finalmente, se siembran los anina dispersos para mantenerlos en cultivo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la calidad de la preparación de ASIN R mediante experimentos de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica de nuestros métodos existentes, como la extracción por digestión completa del tejido pancreático y la disociación o clasificación de hechos, es que permite un aislamiento rápido del material pancreático primario disperso durante más de una semana. En cultivo, este método puede ayudar a responder a una pregunta clave en el campo del páncreas exocrino, como es descifrar mejor los mecanismos fisiológicos, así como todos los procesos de transdiferenciación y tumorgénesis que tienen lugar en el páncreas. Este procedimiento se realiza en una cabina de seguridad microbiológica estéril de nivel dos con equipo de disección estéril.

Consulte el protocolo de texto para ver todas las recetas de búfer. Después de sacrificar a un ratón de acuerdo con el protocolo de texto, asegúrelo y use etanol al 70% para rociar el abdomen con tijeras y pinzas de disección. Haz una incisión en forma de V en la zona genital y extiéndela hasta el diafragma para abrir completamente la cavidad abdominal.

Coloque los lóbulos del hígado contra el diafragma, luego exteriorice el intestino y el colon colocándolos a la izquierda. Después de localizar el recto con un par de pinzas curvas y unas tijeras de disección, agárralo y succiónalo. Con el mismo par de pinzas, tire del intestino para desenrollar cuidadosamente el intestino desde el recto hasta el estómago.

El páncreas ahora se puede ubicar como una pequeña franja entre el estómago y el comienzo del intestino con sus ligaduras al bazo intactas. Con unas tijeras Noyes y un par de pinzas, corte con cuidado el páncreas a lo largo del intestino y libérelo con el bazo del resto del tracto digestivo. Mientras sostiene el bazo, seccione cuidadosamente el páncreas unido a él, asegurándose de que no se recoja grasa mesentérica o tejido adyacente.

A continuación, enjuague el páncreas dos veces en una solución salina de equilibrio de X Hank o pose blanca HBSS. El tejido flotará, lo que hará que sea fácil de ver y debe extraerse del páncreas. Enjuague el páncreas dos veces más en HBSS.

Si el páncreas necesita ser transportado a la instalación de cultivo celular, manténgalo en HBSS en hielo para disociar el páncreas. Comience colocándolo en una placa de Petri estéril que contenga cinco mililitros de HBSS usando pinzas en un bisturí. Pica el tejido en trozos pequeños, de aproximadamente uno a tres milímetros cúbicos.

Transfiera el tejido a un tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros y centrifugue durante dos minutos a 450 G y cuatro grados centígrados. Aspire y deseche el sobrenadante para eliminar los fragmentos celulares y las células sanguíneas. A continuación, agregue 10 mililitros de Kase una solución y, con una pipeta serológica de 25 mililitros, transfiera el tejido a un matraz de 25 centímetros cuadrados.

Incubada durante 20 a 30 minutos a 37 grados centígrados y cada cinco minutos utilizando pipetas serológicas estériles que disminuyen gradualmente de tamaño, pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para disociar mecánicamente el tejido pancreático. Cuando los fragmentos de tejido están completamente disociados y la solución está turbia. Detenga la reacción enzimática agregando 10 mililitros de solución de lavado tamponada en frío.

Luego transfiera la mezcla a un tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros. Transfiera la muestra a un tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros y centrifugue durante dos minutos. Luego aspire con cuidado y deseche el sobrenadante para eliminar la colegiata una solución.

Lave el pañuelo tres veces con 10 mililitros cada uno de solución de lavado tamponada. Centrifugado durante tres minutos Después de cada enjuague Después del último lavado, resus suspender el pellet celular en siete mililitros de medio de boca de camino completo. Filtrar a través de un filtro de 100 micrómetros, que permitirá el paso de la ASIN pancreática a nuestras estructuras de 10 a 15 células.

A continuación, enjuague el filtro con seis mililitros de medio de mits de manera completa. Ver dos mililitros por pocillo de la asinina aislada en un plato de seis bien cultivados. E incubarlos durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5%CO2.

A continuación, transfiera la asinina en suspensión a una nueva placa de seis pozos cultivados para eliminar las células contaminantes y los restos celulares que se han adherido durante la noche a la semilla en los andamios de la matriz. Un día antes, cubra una placa de cultivo de seis pocillos con colágeno tipo uno incubando un mililitro de solución de colágeno en cada pocillo durante una hora a 37 grados centígrados. Aspire la solución y use PBS para enjuagar las células dos veces.

Deje que los pocillos se sequen durante al menos 12 horas en un ambiente estéril antes de usarlos. Coloque el plato de cultivo de seis pocillos en un gabinete de seguridad de nivel dos. A continuación, transfiera la asinina primaria aislada a los pocillos de la placa codificada en colágeno e incube durante dos días para permitir que se adhieran al sustrato al tercer día.

Cambie el medio de cultivo para eliminar las células no viables y continúe reemplazando el medio cada tres días. Con el tiempo y el cultivo, las células se extenderán progresivamente sobre el soporte que contiene colágeno. Aquí se muestra una representación típica del primer día de asinina pancreática, aislada.

Con este protocolo, la transferencia de la asina a nuestras células a una placa de cultivo fresca elimina los fragmentos celulares contaminantes y las células adherentes, como se muestra en esta figura. Cuando se cultivan en colágeno tipo uno, las células asar se propagan y pierden su morfología asar. Y la organización 3D dando lugar a una monocapa de células en forma de huso Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la rapidez de la extracción del páncreas y la atención dedicada a las disociaciones enzimáticas y mecánicas son esenciales para el rendimiento adecuado y la calidad de la identificación dispersa.