Electroforesis en gel de DNA

DNA Gel Electrophoresis

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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DNA Gel Electrophoresis

2.2: Gel Purification

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09:22 min

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February 01, 2013

Overview

Electroforesis de ADN es una técnica utilizada para la detección y separación de las moléculas de ADN. Un campo eléctrico se aplica a una matriz de gel de agarosa, y dentro del gel, carga de partículas serán migrar y separar según el tamaño. Los fosfatos cargados negativamente de la espina dorsal de la DNA causan fragmentos de ADN avanzar hacia el ánodo – un electrodo cargado positivamente.

El video explica el mecanismo por el que ADN fragmentos se resuelven en un gel de agarosa, y proporciona un procedimiento generalizado paso a paso de cómo preparar geles de agarosa, cargar muestras de ADN, un gel de DNA, visualizar fragmentos de ADN y deshacerse del gel y almacenador intermediario corriente concluido el experimento.

Procedure

Electroforesis de ADN es una técnica utilizada para separar e identificar fragmentos de ADN según el tamaño.

Fragmentos de ADN de diferentes tamaños se cargan en un gel poroso hecho de agarosa, un carbohidrato que se encuentra en las algas rojas.

Cuando se aplica un campo eléctrico, los fragmentos se migran por el gel, gracias a los grupos negativamente cargados del fosfato en los nucleótidos del ADN.

Pequeños trozos de ADN migrará más fácilmente a través del gel que fragmentos más grandes, que tienen un tiempo más difícil moverse a través de la matriz de gel.

Cuando el gel es completa la situación de sus muestras de ADN puede compararse a una serie de fragmentos o bandas de tamaños conocidos, llamados una escalera de ADN.

Entonces puede confirmar la presencia de su fragmento de interés basado en su tamaño, que se determina comparando la ubicación relativa de la muestra a los fragmentos de la escalera.

Geles de agarosa se preparan con un peso en solución de porcentaje de volumen. Así que 1 gramo de agarosa en 100 ml de tampón hará un 1% gel. Geles por ciento inferiores se resolverán mejor fragmentos más grandes y más altos geles por ciento harán fragmentos más pequeños fáciles de identificar. Para iniciar el proceso de elaboración de gel, pesar la masa adecuada de agarosa en un erlenmeyer.

Añadir tampón corriente al matraz, para que el volumen de tampón no es mayor que 1/3 de la capacidad del matraz. Luego agitar para mezclar.

Fundir la mezcla de agarosa tampón calentando en el microondas a máxima potencia. Cada treinta segundos, retire el matraz y agitar el contenido para mezclar bien. Repita hasta que la agarosa se disuelva completamente.

A continuación añadir el bromuro de etidio a una concentración de 0.5 mg / ml. bromuro de etidio es un aromático compuesto que encaja entre los pares de bases del ADN, o intercala y hace ADN emitir fluorescencia naranja intenso bajo luz UV. Es importante tener en cuenta que el bromuro de etidio es un agente carcinógeno por lo que siempre se deben usar guantes al manipular el gel que contienen este compuesto.

Para evitar que la bandeja de gel warping, deje enfriar el agarosa al colocarlo en baño María a 65 º c.

Como la agarosa es enfriamiento, preparar el molde de gel mediante la colocación de la bandeja del gel en el aparato de fundición. Como alternativa, puede usar cinta para sellar los bordes abiertos de la bandeja de gel para crear el molde. Colocando un peine en el gel crea los pozos donde se carga el ADN. Asegúrese de que el peine crea un pozo que es del tamaño adecuado para su muestra de ADN.

Verter la agarosa fundida en el molde de gel y deje que se endurezca a temperatura ambiente.

Después de que ha endurecido la agarosa, quitar el peine. Si el gel no se va a utilizar inmediatamente, envuelva en envoltura de plástico y almacenar a 4 º c hasta su uso.

Si el gel se va a utilizar inmediatamente, colóquelo en la caja de gel.

Para comenzar este procedimiento, agregue carga gel colorante a las muestras de ADN que se separará. Carga del tinte se hace típicamente en una concentración de X 6. Carga del tinte ayuda a visualizar y cargar las muestras en los pocillos y ayuda a determinar hasta qué punto las muestras han emigrado durante el funcionamiento.

Establecer la fuente de alimentación a la tensión deseada.

Ahora agregue suficiente buffer de corriente en la caja de gel para cubrir la superficie del gel. Asegúrese de utilizar el mismo buffer de corriente como el que se utiliza para preparar el gel.

Conecte los cables de la caja del gel a la fuente de alimentación y enciéndalo. Recuerda que el ADN está cargado negativamente y se moverá hacia el ánodo, que es positiva y generalmente de color rojo. Asegúrese de que no se conecte el cable negro, o cátodo, a la parte inferior de la caja de gel. Así que no olvides, ten en cuenta que gatos negros son de mala suerte, o negativo y el cátodo negro es negativo. Correr el gel a rojo, o el ánodo. Para verificar que la caja del gel y la fuente de alimentación están trabajando; la aparición de burbujas en los electrodos indica que la corriente está atravesando.

Retire la tapa de la caja de gel. Lentamente y con cuidado coloque las muestras de ADN en el gel. Una vez más, el tinte de la carga de la muestra permite que la muestra a sumergirse en el gel y ayudará a rastrear cuánto ha viajado la muestra. Siempre se debe cargar un marcador del tamaño de ADN, o escalera, junto con las muestras experimentales.

Vuelva a colocar la tapa. Comprobar que los electrodos estén enchufados en las ranuras correctas en la fuente de alimentación.

Conecte la alimentación. Correr el gel hasta que el tinte ha migrado a una distancia apropiada.

Cuando el funcionamiento es completo, apague la fuente de alimentación y retire la tapa de la caja de gel.

Retirar el gel de la caja de gel y escurrir el exceso de tampón sobre la superficie del gel. Coloque la bandeja de gel en toallas de papel para absorber cualquier buffer de corriente restantes.

Para visualizar los fragmentos de ADN, retire el gel de la bandeja de gel y exponer el gel a luz ultravioleta ultra.

Fragmento de la DNA debe aparecer como bandas fluorescentes naranja. Tomar una fotografía del gel.

Al final del experimento, como deshacerse del buffer gel y funcionamiento por los reglamentos de la institución. Una vez más, recuerda siempre manejar los buffers gel y funcionamiento con guantes para evitar la exposición de bromuro de etidio.

Ahora que ya has visto cómo realizar la electroforesis del gel de DNA. Echemos un vistazo a algunas aplicaciones posteriores y las variaciones de este método altamente útil.

Aquí se puede apreciar un resultado de electroforesis en gel de agarosa después de separar los productos de PCR. Los fragmentos de ADN en el gel son accesibles como bandas claramente definidas. El estándar de ADN o la escalera debe ser separada en un grado que permite la determinación de la utilidad de los tamaños de las bandas de la muestra. En este ejemplo, fragmentos de ADN de pares de bases 765, 880 pares de bases y 1022 de pares de bases se separan en un gel de agarosa al 1,5% con una escalera de DNA 2-log.

Además de confirmar la presencia de un fragmento de ADN de interés, electroforesis en gel de DNA pueden combinarse con procedimientos de purificación del gel. Normalmente se utiliza una cuchilla de afeitar para cortar el fragmento de ADN de interés, por lo que puede ser recogido y recuperado de la muestra de ADN en su interior.

Electrophesis de gel de agarosa puede combinarse también con transferencia blotting, que implica permitir ADN o ARN de transferencia a una membrana de celulosa donde sondas radiactivas pueden usarse para identificar secuencias específicas de DNA o RNA en su electroforéticamente separados muestra.

Electroforesis en gel de DNA estándar no es ideal para la separación de alto peso molecular mayor que 15-20 kb de tamaño, como la DNA genomic de la DNA. Para separar muestras grandes de ADN, se utilizan gel de electroforesis de pulso del campo, que consiste en someter el gel a un campo eléctrico cambiante o pulsante, en diferentes direcciones. Esta técnica consiste en un aparato corriente gel especializado, que tiene pares de electrodos dispuestos en diferentes orientaciones en el gel. Esto puede ser usado para detectar diferencias en tamaños del genoma entre las poblaciones de organismos, como las muestras de ADN agrupados de diferentes comunidades microbianas, ves aquí que proceden de ambientes lacustres diferentes.

Sólo has visto una introducción a la electroforesis en gel de DNA. Os mostramos el concepto detrás del método, cómo preparar gel de la agarosa, cómo cargar sus muestras, como para correr el gel y analizar y algunos comunes aplicaciones de agarosa electroforesis del gel. Gracias por mirar y buena suerte con el funcionamiento de su gel.

Transcript

DNA Gel Electrophoresis is a technique used to separate and identify DNA fragments based on size.

DNA fragments of various sizes are loaded into a porous gel made from agarose – a carbohydrate found in red algae.

When an electric field is applied, the fragments will migrate through the gel, thanks to the negatively charged phosphate groups in DNA nucleotides.

Smaller pieces of DNA will more easily migrate through the gel than larger fragments, which have a more difficult time moving through the gel matrix.

When the gel run is complete the location of your DNA samples can be compared to a series of fragments or bands of known sizes, called a DNA ladder.

The presence of your fragment of interest can then be confirmed based on its size, which is determined by comparing the relative location of your test sample to the fragments of the ladder.

Agarose gels are prepared using a weight over volume percentage solution. So 1 gram of agarose in 100 ml of buffer will make a 1% gel. Lower percent gels will better resolve larger fragments and higher percent gels will make smaller fragments easier to identify. To start the gel-making procedure, weigh out the appropriate mass of agarose into an Erlenmeyer flask.

Add running buffer to the flask, so that the volume of buffer is no greater than 1/3 of the capacity of the flask. Then swirl to mix.

Melt the agarose/buffer mixture by heating in a microwave at maximum power. Every thirty seconds, remove the flask and swirl the contents to mix well. Repeat until the agarose has completely dissolved.

Next add ethidium bromide to a concentration of 0.5 mg/ml. Ethidium Bromide is an aromatic compound that fits in between individual base pairs of DNA, or intercalates, and causes DNA to emit intense orange fluorescence under UV light. It is important to note that ethidium bromide is a carcinogen so gloves should always be worn when handling gels containing this compound.

To prevent the gel tray from warping, let the agarose cool by placing it in a 65ºC water bath.

As the agarose is cooling, prepare the gel mold by placing the gel tray into the casting apparatus. As an alternative, you can use tape to seal the open edges of the gel tray to create the mold. Placing a comb into the gel creates the wells where DNA is loaded. Make sure the comb will create a well that is the appropriate size for your DNA sample.

Pour the molten agarose into the gel mold and allow it to harden at room temperature.

After the agarose has hardened, take out the comb. If the gel is not going to be used immediately, wrap it in plastic wrap and store at 4ºC until use.

If the gel is going to be used immediately, place it in the gel box.

To begin this procedure, add gel-loading dye to the DNA samples to be separated. Loading dye is typically made at a 6X concentration. Loading dye helps to visualize and load samples into the wells and helps determine how far the samples have migrated during the run.

Set the power supply to the desired voltage.

Now add enough running buffer into the gel box to cover the surface of the gel. Make sure to use the same running buffer as the one used to prepare the gel.

Connect the leads of the gel box to the power supply and turn it on. Remember that DNA is negatively charged and will move toward the anode, which is positive, and generally red in color. Make sure not to connect the black lead, or cathode, to the bottom of the gel box. So you don’t forget, keep in mind that black cats are bad luck, or negative, and the black CAThode is therefore negative. Run your gel to red, or the anode. To verify that both the gel box and the power supply are working; the appearance of bubbles at the electrodes indicates that current is passing through.

Remove the lid of the gel box. Slowly and carefully load the DNA samples into the gel. Again, the loading dye in the sample allows the sample to sink into the gel and will help to track how far the sample has traveled. A DNA size marker, or ladder, should always be loaded along with the experimental samples.

Replace the lid. Double check that the electrodes are plugged into the correct slots in the power supply.

Turn on the power. Run the gel until the dye has migrated to an appropriate distance.

When the electrophoresis run is complete, turn off the power supply and remove the lid of the gel box.

Remove the gel from the gel box and drain off excess buffer on the surface of the gel. Place the gel tray on paper towels to absorb any remaining running buffer.

To visualize the DNA fragments, remove the gel from the gel tray and expose the gel to ultra violet light.

DNA fragment should show up as orange fluorescent bands. Take a picture of the gel.

At the end of the experiment, properly dispose of the gel and running buffer per institution regulations. Again, remember to always handle the gel and running buffers with gloves to avoid ethidium bromide exposure.

Now that you’ve seen how to perform DNA gel electrophoresis. Let’s have a look at some downstream applications and variations of this highly useful method.

Here you see an agarose gel electrophoresis result after separating PCR products. The DNA fragments loaded into the gel are visible as clearly defined bands. The DNA standard or ladder should be separated to a degree that allows for the useful determination of the sizes of sample bands. In this example, DNA fragments of 765 base pairs, 880 base pairs and 1022 base pairs are separated on a 1.5% agarose gel with a 2-log DNA ladder.

In addition to confirming the presence of a DNA fragment of interest, DNA gel electrophoresis can be combined with gel purification procedures. Typically a razor blade is used to cut out the DNA fragment of interest, so that it can be collected and the DNA sample within it recovered.

Agarose gel electrophesis can also be combined with transfer blotting, which involves allowing DNA, or RNA, to transfer to a cellulose membrane where radioactive probes can be used to identify specific DNA or RNA sequences in your electrophoretically-separated sample.

Standard DNA gel electrophoresis is not ideal for the separation of high molecular weight DNA greater than 15-20 kb in size, like genomic DNA. To separate large DNA samples, pulse field gel electrophoresis is used, which involves subjecting the gel to a changing, or pulsing, electric field in different directions. This technique involves a specialized gel running apparatus, which has pairs of electrodes arrayed in different orientations around the gel. This can be used to detect differences in genome sizes between populations of organisms, like the pooled DNA samples from different microbial communities, you see here which are taken from different lake environments.

You’ve just seen an introduction to DNA gel electrophoresis. We showed you the concept behind the method, how to prepare the agarose gel, how to load your samples, how to run the gel, and analyze it and some common applications of agarose gel electrophoresis. Thanks for watching and good luck with running your gel.

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