Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

Un protocolo para la entrega intraductal no invasiva de los reactivos acuosos para la glándula mamaria de ratón se describe. El método se aprovecha de la inyección localizada en los pezones de las glándulas mamarias dirigidos específicamente conductos mamarios. Esta técnica es adaptable para una variedad de compuestos que incluyen ARNsi, agentes quimioterapéuticos y moléculas pequeñas.

El objetivo general de este procedimiento es administrar reactivos acuosos de forma no invasiva a la glándula mamaria del ratón. Introductorio. Esto se logra primero anestesiando al ratón y eliminando el vello que rodea los pezones. El segundo paso es eliminar la piel muerta que cubre la punta de los pezones con micropinzas.

A continuación, se inyecta una solución acuosa en el pezón con una aguja de calibre 33. El paso final es asegurarse de que la inyección haya sido exitosa observando el lugar de la inyección para detectar posibles inflamaciones, lo que sugeriría una inyección de almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección en la glándula mamaria. En última instancia, el éxito del procedimiento se puede determinar mediante la visualización del árbol dúctil después de la inyección de azul de Evans.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de mama, como la contribución de genes específicos durante varias etapas de la tumorgénesis del tumor de memoria. Para comenzar, prepare 160 microlitros de colorante azul Evans al 0,2% en solución salina estéril tamponada con fosfato para cada ratón que se inyectará antes de la inyección. Pesa cada ratón y registra su peso corporal.

A continuación, anestesia al ratón de uno en uno, utilizando una cámara de flúor y aplique lubricante ocular. Una vez sedado, coloque una nariz de isof flúor e inyecte meloxicam de cinco a 10 miligramos por kilogramo por vía subcutánea antes del procedimiento. Como analgésico durante el procedimiento, controle continuamente al ratón para detectar cambios en la frecuencia respiratoria y ajuste el nivel de isde flúor en consecuencia, especialmente si la frecuencia respiratoria del ratón indica que es necesario reducir el nivel de anestesia. A continuación, prepare el área del pezón para la inyección aplicando una crema depilatoria de venta libre.

Espere cinco minutos y luego retire suavemente el cabello suelto con el aplicador de punta de algodón. Con movimientos circulares, retire cualquier residuo de crema con toallas de papel húmedas unidas con agua tibia. A continuación, fije el ratón bajo el estereoscopio sujetando suavemente las extremidades con cinta adhesiva y limpie los lugares de inyección con hisopos con alcohol.

Para empezar, localice los pezones que se van a inyectar debajo del estereoscopio. A continuación, utilice unas pinzas finas de microdisección para eliminar cualquier piel muerta que cubra la abertura del pezón. No es necesario cortar el pezón para la inyección.

A continuación, cargue 11 microlitros de solución inyectable en una jeringa de 50 microlitros equipada con una aguja de cubo metálico de calibre 33 adherida a ella. Un microlitro del fluido de inyección a menudo se filtra después de la inyección, lo que resulta en el objetivo final de 10 microlitros de soluciones inyectadas con éxito. Sujete el chupete suavemente con las pinzas finas y levántelo ligeramente para colocarlo para la inyección.

A continuación, inyecte 11 microlitros en cada glándula del primer y último par de glándulas mamarias, ya que requieren un volumen menor que los pares intermedios para llenar completamente el árbol dúctil de la glándula. A continuación, inyecte 21 microlitros en cada glándula del segundo al cuarto par de glándulas mamarias. La tasa de inyección debe mantenerse en aproximadamente 40 microlitros por minuto para minimizar cualquier daño potencial causado por el fluido que se mueve rápidamente dentro de los lúmenes ductales.

Después de la inyección. Observe el sitio de la inyección. No debe haber signos de traumatismo en la región del pezón o en el tejido circundante.

Hinchazón en la zona que rodea el pezón. Probablemente indica una inyección de almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección ductal exitosa. A continuación, retira al animal del cono de la nariz y llévalo a una jaula separada para su recuperación.

Coloque la jaula debajo de una lámpara de calor para prevenir la hipotermia y ayudar en la recuperación. Aloja al animal individualmente y vigílalo de cerca hasta que recupere la conciencia y la movilidad. Una vez finalizado el estudio, se sacrificó a los ratones por dislocación cervical después de la aplicación de gas comprimido CO2 en una cámara aislada.

A continuación, extirpar las glándulas mamarias y continuar con el manejo adecuado de la muestra para el análisis de interés. Aquí se muestra la glándula mamaria de un ratón antes y después de que se inyectara a través del pezón con el tinte azul de Evan. La región del pezón no muestra hinchazón ni daño tisular, lo que sería causado por la inyección del tinte en la almohadilla de grasa que rodea los conductos.

El tinte azul difuso que se ve en la imagen de la derecha es un buen indicador de una inyección correcta. Esto se puede validar observando toda la glándula o una sección transversal después de la escisión de la glándula. En todo el análisis de la montura que se muestra aquí, la glándula inyectada en azul de Evans muestra toda la glándula llena de tinte sin dañar las estructuras nativas del pato.

Así lo confirma Carmen Dye, que también destaca las estructuras dúctiles. También es posible utilizar este método para la administración de moléculas terapéuticas como el irna a las células ductales. En la imagen que se muestra aquí, se inyectó un irna marcado con fluorescencia que se dirige a la muñilla falciforme, un gen no esencial, y luego se obtuvieron imágenes del tejido 48 horas después para mostrar la localización de las moléculas.

Siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la eliminación de ARN, se pueden realizar para responder preguntas adicionales relacionadas con el papel de un gen en particular en el desarrollo de la memoria o la tumorgénesis.