Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

El objetivo general de este procedimiento es la evaluación preclínica eficiente de los inhibidores de la tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda. Esto se logra realizando primero un análisis de sangre occidental para confirmar la inhibición de la diana en las células leucémicas cultivadas. El segundo paso es evaluar la actividad funcional mediante un ensayo clongénico en metilcelulosa o daga blanda.

Los siguientes estudios farmacodinámicos se utilizan para evaluar la inhibición de dianas en blastocitos leucémicos en la médula ósea de ratones trasplantados con leucemia humana. Los datos resultantes se utilizan para determinar la dosis y la pauta de administración necesarias para una inhibición eficaz de la diana in vivo. En última instancia, esta estrategia se utiliza para evaluar la eficacia terapéutica de los TKI in vivo mediante imágenes bioluminiscentes.

Esta estrategia está diseñada para encontrar el mejor candidato para el inhibidor de la tirosina cinasa para su avance a la clínica. Los procedimientos descritos en este vídeo pueden utilizarse para evaluar eficazmente los inhibidores de la tirosina quinasa in vitro e in vivo, para identificar agentes dirigidos con potencial terapéutico y para comparar múltiples compuestos, respondiendo así a preguntas clave en los flujos de trabajo de desarrollo de fármacos. Los protocolos presentados aquí se centran en el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas frente a los receptores tirosina quinasas.

Sin embargo, estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para la evaluación preclínica de otros agentes moleculares dirigidos para el tratamiento de la leucemia aguda. En cada pocillo, se colocan cinco veces 10 de las seis células leucémicas cultivadas en 400 microlitros de medio de crecimiento y se incuban a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante dos o tres horas. A continuación, añadir 100 microlitros de inhibidor de la tirosina quinasa en medio y cultivar durante otros 60 minutos.

Asegúrese de que el inhibidor de la tirosina cinasa esté en solución durante los 60 minutos de incubación del cultivo. Prepare el tampón de lisis si los cultivos no se van a tratar con paté antes de la cosecha. Agregue inhibidores de la fosfatasa al tampón de lisis.

Prepare también la solución probada de inhibidor de la fosfatasa de vanadato. Ahora diluya 60 microlitros de vanadato probado en 940 microlitros de medio completo. Agregue 100 microlitros de vanadato probado diluido por pocillo.

A continuación, incube las muestras en una incubadora de cultivos celulares. Después de tres minutos, coloque el plato sobre hielo. Recoja las celdas y centrifugue en tubos de micro fuga fríos a 2, 500 RPM durante cinco minutos.

Aspire los sobrenadantes, luego vuelva a suspender los gránulos celulares en 120 microlitros de tampón de lisis y coloque las muestras en hielo durante 15 minutos. Para clarificar la centrífuga de lisados, las muestras, transfiera los sobrenadantes a tubos fríos frescos. Almacene la muestra lisada a menos 80 grados centígrados utilizando una aguja estéril de gran diámetro con punta roma Aliquot cuatro mililitros de medio base de metilcelulosa humana en tubos cónicos de 50 mililitros.

A continuación, añada 500 microlitros de 10 XTKI o vehículo en medio de crecimiento, y cuádruple la mezcla durante 10 segundos. Ahora cosecha las células. Prepare una suspensión celular diez veces concentrada en un medio de crecimiento.

Agregue 500 microlitros de suspensión celular a la mezcla de metilcelulosa. Luego vórtice durante 10 segundos. Y sentémonos durante 10 minutos.

Para eliminar las burbujas, extraiga cuatro mililitros de la mezcla de metilcelulosa en una jeringa de cinco mililitros con una aguja estéril de gran diámetro sin filo. A continuación, dispense un mililitro en el centro de 3 placas de cultivo de tejidos de 35 milímetros. Agite los platos hasta que el fondo esté completamente cubierto con metilcelulosa.

Para cada placa de metilcelulosa, prepare una placa de cultivo de tejido estéril de 10 centímetros con dos placas de cultivo de tejido adicionales de 35 milímetros llenas de agua estéril. Para garantizar un ambiente húmedo, coloque los cultivos en una incubadora con camisa de agua a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 10 a 14 días. Cuente las colonias usando una etapa de microscopio con una cuadrícula, o usando una colonia automatizada, las contracolonias deben tener más de 20 celdas y no superponerse.

Comience el siguiente paso recolectando células de cara de tronco por centrifugación. Después de un lavado con PBS, vuelva a suspender los gránulos a una concentración adecuada para la línea celular en particular. Después de desinfectar los guantes, inyecte 100 microlitros de las células en la vena de la cola de ratones gamma de seis a 12 semanas de edad.

Trasplantar al menos tres animales por grupo. Mantenga a los ratones con sulfato de gentamicina. Cuando los ratones hayan desarrollado leucemia, se pesa a los animales y se administra el TKI recién preparado o el tratamiento del vehículo por inyección o por sonda nasogástrica oral.

Si desea evitar el tratamiento de la fecha, prepare la solución PV como se detalla en el protocolo de texto en los momentos apropiados. Después del tratamiento, extraiga el fémur de cada fémur. Enjuague la médula ósea con un mililitro de PBS frío o una solución PV diluida a temperatura ambiente con una aguja de calibre 27.

Si se trata con PV incubado a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, prepare los lisados y analice los niveles de fosfoproteínas y proteínas totales como se describió anteriormente. A continuación, mediante citometría dent, cuantificación, fosfoproteína relativa y niveles de proteínas totales para cada muestra, incluidos los controles. Para comenzar la evaluación de la actividad antileucémica, Allah, al menos seis ratones por grupo.

Identificación de los ratones mediante un puñetazo en la oreja. Agregue enriquecimiento a las jaulas para reducir el potencial de agresión provocada por la jaula. Después de trasplantar ratones con una línea celular de leucemia de interés, trate a los ratones con el inhibidor o vehículo de tirosina cinasa.

Según el diseño experimental, monitoree el estado de salud de los ratones diariamente a través del examen físico y la determinación del peso. Los síntomas esperados de la leucemia incluyen reducción del nivel de actividad, pérdida de peso, parálisis de las extremidades traseras e infecciones oculares. El injerto y el desarrollo de la leucemia se monitorizan hasta dos veces por semana mediante un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo.

Para prepararse para la toma de imágenes, haga una solución y filtro Delucci de trabajo de 15 miligramos por mililitro, esterilícela a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Después de anestesiar al ratón administrar 150 miligramos por kilogramo de peso corporal Lucifer mediante inyección IP. Capture dos series de imágenes con exposiciones secuenciales de 30, 60 y 92, y una imagen final con una exposición 122.

Después de la toma de imágenes, regrese a los ratones a sus jaulas y controle la recuperación de la anestesia. Dependiendo de la intensidad de la bioluminiscencia, los tiempos de exposición pueden variar. Los tiempos de exposición óptimos deben estar predeterminados para un modelo determinado y mantenerse consistentes de modo que las intensidades de la señal para los puntos de tiempo individuales sean comparables en todo el estudio.

El análisis de datos incluye la determinación de la intensidad de bioluminiscencia para cada ratón utilizando el software de adquisición y análisis de imagen viva 3.2 para determinar los valores de flujo total medidos en fotones por segundo dibujando regiones de interés de tamaño idéntico sobre cada ratón. Al final del estudio, diseccione los ratones y registre observaciones como hígado, bazo o ganglios linfáticos agrandados y médula ósea pálida. Recoja las células por centrifugación, suspenda las células en PBS que contengan 2% de FBS e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de recolectar las células se tiñen con 20 miligramos por mililitro, DPI y ZI conjugaron anti-CD 45 humano o IgG de ratón un anticuerpo de control de isotipo. Luego, evalúe el injerto de leucemia mediante citometría de flujo en la población viable DAPI negativa y determine el porcentaje de células CD 45 positivas como porcentaje de blastocitos en la médula ósea. Inicialmente, el análisis de sangre occidental se utiliza para confirmar la inhibición de la diana en células leucémicas cultivadas.

En este ejemplo, TKIC parece que el TKIB más potente es menos potente y TKIA no tiene ningún efecto. A continuación, se evalúa la actividad funcional mediante ensayos clonógenos en metilcelulosa o tratamiento de agricultura blanda con el número de colonias significativamente reducido de TKI en metilcelulosa. En esta una línea celular LL.

El tratamiento de esta línea celular A ML con TKI da como resultado una tendencia hacia la disminución del número de colonias. El conteo preciso de las células viables antes de la siembra en agar blando es importante para la consistencia entre los experimentos y también para evitar errores estándar, solo incluya aireados blandos con una distribución óptima de las colonias. En el análisis del experimento aquí, se utiliza el análisis farmacodinámico para determinar si los TKI pueden inhibir la proteína objetivo in vivo.

Se observa una disminución en los niveles de fosfoproteínas en blastocitos leucémicos aislados de ratones tratados con TKI en relación con el vehículo solo. En este ejemplo, TKIE es más eficaz que TKID. Se puede generar un modelo ortotópico de xenoinjerto de ratón de leucemia aguda en ratones NSG inyectados con una luciferasa que expresa una línea celular LL y se puede utilizar para evaluar los efectos del tratamiento con un ITC A.

En cuanto al potencial oncogénico, los ratones in vivo tratados con TKI tenían un nivel significativamente menor de bioluminiscencia, lo que indica una menor carga de leucemia en relación con los ratones tratados solo con el vehículo. Después de 10 días de tratamiento, todos los ratones tenían un nivel bajo de bioluminiscencia que no fue significativamente diferente entre los animales tratados con vehículo y los animales tratados con TKI. Por el contrario, a los 19 días después del tratamiento, los ratones tratados con el vehículo tenían una intensidad de bioluminiscencia significativamente mayor.

Mientras que los ratones tratados con una dosis alta de TK, tuve una intensidad de señal mucho menor. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar eficazmente los nuevos inhibidores de la tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda. Con este enfoque, las actividades bioquímicas y antileucémicas se determinan primero en ensayos basados en células in vitro, y luego en modelos de xenoinjertos in vivo después de su desarrollo.

Esta estrategia allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo de fármacos exploraran compuestos más eficaces e interesantes para el tratamiento de la leucemia aguda y otros tipos de cáncer.