High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

La microinyección es una técnica común que se utiliza para entregar construcciones de ADN, ARNm, oligonucleótidos antisentido morfolino u otros tratamientos en los huevos, embriones y células de diversas especies.

El objetivo general de este procedimiento es realizar microinyecciones de alto rendimiento de cigotos de erizos de mar. Para ello se induce el desove en los erizos de mar y se recogen gametos machos y hembras. A continuación, los huevos se trituran con agua de mar ácida y se inmovilizan en fila en placas de Petri.

A continuación, se añaden espermatozoides a los óvulos para fecundarlos y se realiza una microinyección del Sr.N.A deseado después de la microinyección. El agua de tres A T que contiene esperma se intercambia por agua de mar dulce. Estos embriones pueden ser examinados por su morfología y la expresión temporal y espacial de ARN y proteínas específicas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la electroporación, la perfección del labio, la micropartícula, el bombardeo y la transducción, es que permite la entrega de cualquier solución con una eficiencia del 100% utilizando reactivos mínimos. Este método permite una microinyección eficiente y fiable de 100 a 400 x en una sola placa de miles de X por experimento, proporcionando un método de alto rendimiento para el análisis posterior. Antes de realizar este experimento, prepare todas las soluciones madre y el equipo necesario.

Consulte el documento adjunto para obtener recetas, se necesitará una pipeta bucal para manipular suavemente los huevos. Para preparar una, comience sosteniendo una micropipeta de vidrio con ambas manos sobre una llama abierta mientras el vidrio comienza a derretirse, tire con cuidado de los extremos de la pipeta en direcciones opuestas hasta que la pipeta se separe en dos mitades. A continuación, conecte una pipeta extraída a un tubo de plástico de 50 a 70 centímetros de longitud.

Aplique paraform para crear un sello hermético. Inserte una punta filtrada estéril P 20 o P 200 en el otro extremo del tubo para usarla mientras la boquilla finalmente corta el extremo de la micropipeta de vidrio con unas tijeras para ajustar el diámetro de la punta, el diámetro óptimo excederá ligeramente el diámetro del huevo, que es de aproximadamente 80 micrómetros. A continuación, prepare platos recubiertos de sulfato de protamina.

Coloque placas de Petri de poliestireno de 2060 milímetros por 15 milímetros en la mesa de trabajo y retire las tapas de los platos. Estos también se utilizarán como platos para verter una solución de sulfato de protamina al 1% en lo sucesivo, denominada solución PS en cada plato. Agregue lo suficiente para cubrir la superficie e incube durante al menos dos minutos después de la incubación.

Retire la solución PS y guárdela para usarla más tarde. La solución de PS sobrante se puede reutilizar muchas veces en tres meses cuando se almacena a cuatro grados centígrados. Coloque los platos tratados con PS en un vaso de precipitados lleno de agua destilada.

A continuación, coloque el vaso de precipitados bajo el chorro de agua destilada durante al menos 10 minutos. Los platos recubiertos de PS se pueden utilizar inmediatamente o secar al aire para su almacenamiento. Cúbralos para evitar la acumulación de polvo.

Se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta por un mes. Para fabricar capilares de inyección, use un extractor de agujas. Los ajustes del extractor de agujas deben determinarse empíricamente como se indica en el manuscrito.

Para desovar el erizo de mar, saque un animal del tanque con una red y colóquelo sobre una toalla de papel. Luego levanta al animal y sujétalo fuertemente. Agítalo.

Alternativamente, realice una inyección emmic de la siguiente manera. Después de sacar a un animal del tanque, sosténgalo con una mano y use una aguja de calibre 20 conectada a una jeringa de 10 mililitros para inyectar un mililitro de cloruro de potasio 0.5 molar en la membrana perial, la única parte blanda del animal. Después de uno a 10 minutos, el sexo del animal se hará evidente.

Los machos comenzarán a liberar esperma blanco y las hembras comenzarán a liberar óvulos amarillos. Si el animal es macho, recoja el esperma seco de la superficie del animal con una pipeta para transferirlo a un tubo de 1,5 mililitros. El esperma seco puede almacenarse a cuatro grados centígrados durante una semana sin pérdida significativa de la función biológica.

Si el animal es una hembra, sumerge los poros de gno en un vaso de precipitados lleno de agua de mar para recoger sus carnes de g. Los huevos liberados por los poros de los gno se asentarán por gravedad. Después del desove, filtre los huevos de los desechos, como las espinas de los animales, vertiendo el agua de mar que contiene los huevos.

A través de una malla de filtro de nailon de 80 micras en un vaso de precipitados limpio sobre hielo. Para dejar los huevos, transfiera hasta un mililitro de huevos a 100 mililitros de agua de mar ácida en un vaso de precipitados de plástico, agite suavemente los huevos y déjelos reposar sobre hielo durante 10 minutos. Después del tratamiento, vierta con cuidado el agua de mar ácida.

Luego agregue agua de mar fresca y deje que los huevos se asienten en el hielo. Otra vez. Los huevos en gelatina se pueden almacenar en hielo hasta por seis horas sin afectar la fertilización. Inmediatamente antes de realizar microinyecciones, vierta de tres a cuatro mililitros de un milimolar, tres de agua TC en cada plato recubierto de PS.

La X debe ser todo tipo antes de la inyección hospitalización El problema puede ocurrir si hay una exposición prolongada a tres 80 c de agua más o adhesivos ónicos, como el sulfato de proteínas puede ser tóxico para el X.So el tiempo de exposición debe estar vinculado, especialmente si el animal de fertilización Se han eliminado. Asegure la punta de la pipeta bucal con los dientes y aspire una pequeña cantidad de agua de mar. Esto aumentará el control sobre los huevos cuando se aspiren.

A continuación, coloque la punta de la micropipeta cerca de los huevos y aspire suavemente varios cientos de huevos, confinándolos dentro de la micropipeta de vidrio. A continuación, mientras mueve la punta en línea recta, sople suavemente fuera de la pipeta y colóquela en el plato para formar una fila. Con una pipeta de vidrio, haga un rasguño en el plato cerca de la línea de huevos de carretera.

Este rasguño se puede usar más adelante para romper la aguja de inyección. Para ajustar el flujo de solución según sea necesario durante el proceso de microinyección. Encienda la estación de microinyección aquí.

Un sistema de inyección de femto jet se utiliza con cuidado con un par de pinzas. Monte el capilar de la aguja en un soporte de carga de aguja. Evite tocar el extremo de la aguja para evitar la contaminación de la abertura de la aguja.

Con una punta de microcargador, cárguelo con 0,5 a 1,0 microlitros de solución de inyección de muestra. Coloque el plato con huevos de carretera en la platina del microscopio y coloque el plato de modo que los huevos estén alineados verticalmente. Cuando se vea a través de los oculares, enfoque los huevos.

Monte con cuidado la aguja cargada en el soporte de la aguja del microinyector y ajuste la posición de la aguja para que la punta esté perfectamente enfocada en el centro del campo de visión. Junto a limpiar la aguja, presione el botón para aplicar la presión máxima viendo a través del microscopio. La solución se verá a medida que se expulsa de la aguja.

Ajuste la presión para que esté en el rango de 90 a 360 HP para la inyección con la presión de compensación a aproximadamente un tercio de la presión de inyección. A continuación, inyecte un óvulo no fertilizado para examinar el flujo de la configuración de la inyección. Con un micromanipulador de joystick, dirija la punta de la aguja de inyección al óvulo no fertilizado.

Para facilitar la entrada de la aguja, cree un ligero temblor golpeando suavemente la platina con un objeto duro como un destornillador. Presione el pedal para inyectar el óvulo. Si el bolo de inyección no es visible, acerque la aguja a la marca del rasguño.

Golpee suavemente la punta de la aguja hasta la marca de rasguño para romper la punta de la aguja de inyección. La abertura de la punta ligeramente más ancha permitirá un flujo de solución más fácil y el borde afilado de la punta rota facilita la entrada de la aguja. Fertilice los óvulos añadiendo espermatozoides inmediatamente después de que la envoltura de fertilización se haga visible.

Inicie las inyecciones con el micro manipulador. Con la mano derecha, presiona la punta de la aguja contra el óvulo fertilizado, causando una ligera hendidura casi simultáneamente. Golpee suavemente la platina del microscopio con el destornillador sostenido por la mano izquierda.

Muévete a lo largo de la línea de cigotos de la carretera usando el controlador de escenario e inyecta tantos cigotos como sea posible. El bolo inyectable no debe exceder una quinta parte del cigoto. Después de 10 a 15 minutos, los óvulos recién fertilizados se endurecerán y ya no se podrán inyectar.

Retire el plato del escenario y, con una pipeta de pasta de plástico, aspire con cuidado el agua de tres TC A que contiene esperma. No deje que los cigotos se sequen y agregue rápidamente agua de mar fresca preenfriada. Tapar el plato incubar a 15 grados centígrados.

Después de la inyección. Monitorear los embriones para detectar cambios fenotípicos o moleculares, según corresponda para el experimento, a fin de determinar si la inyección de construcciones reporteras afectó el desarrollo. Se transcribieron in vitro las construcciones de GFP y m cherry reporter y se microinyectaron en los óvulos recién fertilizados.

Los embriones inyectados que se muestran aquí se pueden distinguir claramente de los no inyectados, que se indican con las flechas. Los embriones se incubaron a 15 grados centígrados durante 24 horas hasta la etapa de blástula y se tomaron imágenes como se puede ver aquí. Los embriones inyectados que están coloreados tienen la misma morfología que los embriones no inyectados, que son grises.

Esto sugiere que la inyección de constructos reporteros no conduce a ningún defecto de desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microinyectar el erizo. La microinyección de cigotos es una herramienta valiosa para la investigación en genética, biología celular y del desarrollo.

Con esta técnica, la comunidad de erizos de mar ha hecho una contribución significativa a nuestra comprensión de las vías de desarrollo, como la especificación de sulfatos, la regulación génica, la expresión génica y las vías bioquímicas que subyacen a la biología del desarrollo.