Name: Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a utilizar pHluorin para evaluar la dinámica de receptores de orientación axónica en cultivos celulares y embriones de pollo mediante electroporación in vivo. Este método permite visualizar el tráfico receptor en tiempo real.

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Agradecemos a Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas por su ayuda. Este trabajo cuenta con el apoyo de CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B y A.J cuentan con el apoyo de las becas La Ligue contre le cancer y Labex DevWeCan, respectivamente.

1. Estrategia de clonación para etiquetar el receptor PlexinA1 con pHluorin
<ol><li>Elija un vector de expresión apropiado como columna vertebral(por ejemplo, el vector de expresión del receptor de ratón plexinA1, un regalo amable del Dr. Andreas Puschel11). Nota: Este vector plexinA1 fue diseñado para lograr la inserción eficiente del receptor ha- o VSV-tagged en la membrana plasmática.</li>
	<li>Amplificar por PCR la secuencia de codificación de pHluorin eclíptica utilizando el plásmido adecuado como plantilla(por ejemplo, receptor GABA A marcado con pHluorin, un regalo amable del Dr. Jacob2). Si es necesario, agregue un sitio de restricción al extremo 5' de la cartilla para facilitar el paso de clonación en la columna vertebral.</li>
	<li>Inserte la secuencia de pHluorin en el marco entre el péptido de señal y la secuencia de codificación del receptor utilizando sitios de restricción(por ejemplo, sitios de restricción NruI/Kpn2I como se describe en la Figura 1B). Nota: Debido a que el péptido de señal que asegura la correcta orientación de los receptores está escindida, el pHluorin debe colocarse después de él. Esto garantiza el reconocimiento del péptido señal y evita la escisión del pHluorin del receptor de interés.</li>
	<li>Secuenciar las construcciones obtenidas para asegurar que no se introdujera ninguna mutación por PCR.</li>
</ol>2. Caracterización Del Receptor De pHluorin-etiquetado In vitro En Células COS7
La capacidad de la proteína de fusión para llegar a la membrana plasmática y su pérdida reversible de fluorescencia a medida que se reduce el pH se puede confirmar mediante el siguiente procedimiento.
<ol><li>Día 1. Placa 1,5 x 105 células COS7 en un plato de fondo de cristal de 35 mm en 2 ml de medio de águila modificado de Dulbecco completo (DMEM - 10% suero fetal bovino - piruvato de sodio de 1 mM - 25 U/ml penicilina/estretomicina - 2,5 μg/ml Anfotericina B - pH 7,4).</li>
	<li>Día 2. Células transfectas: Nota: Las células deben ser 70-80% confluentes.<ol>
<li>Prepare 200 μl de NaCl 150 mM y agregue 3 μg de ADN, es decir, el vector que codifica el receptor marcado con pHluorin. Suavemente vórtice y girar hacia abajo brevemente. Nota: En la Figura 1Bse muestra un mapa del vector pHluorin-plexinA1 utilizado en estos experimentos.</li>
		<li>Añadir 10 μl de reactivo de transfección (o la cantidad adecuada del reactivo utilizado). Vórtice inmediatamente.</li>
		<li>Incubar 10 min en RT.</li>
		<li>Añadir 200 μl de la mezcla reactivo/ADN de transfección a las células.</li>
		<li>Mueva la placa suavemente para lograr la repartición de la mezcla y coloque las células de nuevo a la incubadora de 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 3. Retire el medio de transfección y reemplácelo por 2 ml de DMEM completo fresco.</li>
	<li>Día 4. Realizar imágenes de células vivas de cos7 pHluorin-plexinA1 células transfectadas:<ol>
<li>Preparar dos alícuotas de DMEM medio completo y ajustar el pH a 3,5 y a 9,5, respectivamente. Nota: Para una placa de 35 mm, se necesitan 1,5 ml de cada solución para realizar el experimento.</li>
		<li>Retirar el medio celular y sustituirlo por 1 ml de DMEM pH completo 7.4.</li>
		<li>Prepare una jeringa de 5 ml con un tipo apropiado de tubo para inyectar varios componentes directamente en el medio de cultivo celular sin abrir la cámara del microscopio.</li>
		<li>Utilice un módulo que permita el mantenimiento de una atmósfera de trabajo húmeda de 37 °C, 5% de CO2. Nota: Un enfoque alternativo para el uso de una cámara de CO2 es utilizar un medio tamponado con HEPES (generalmente en el rango de 10-25 mM según el tipo de célula).</li>
		<li>Coloque las células en la cámara y ajuste el tubo y la jeringa. Nota: El microscopio debe equilibrarse antes de comenzar a evitar la deriva mecánica durante la grabación.</li>
		<li>Abra el software de imágenes y seleccione el programa de adquisición multidimensional.</li>
		<li>Encuentre células COS7 transfectadas con el objetivo 40X y marque la posición en el software para cada una de ellas.</li>
		<li>Configure la pila Z para tener una adquisición de profundidad de 15 μm (el enfoque puede cambiar al agregar medios en la placa).</li>
		<li>Configure la exposición para el filtro GFP y la fase.</li>
		<li>Configurar el tiempo de adquisición. Nota: Para todo el experimento con 5 campos de interés, la adquisición cada 20 segundos durante 10 minutos debería ser suficiente.</li>
		<li>Iniciar la adquisición y tomar 5 imágenes de control en DMEM pH 7.4 medio.</li>
		<li>Pausar la adquisición, inyectar 1,25 ml de DMEM completo de pH 3,5 para lograr un pH de 5,5 en el medio de cultivo, marcar el evento en el software y reanudar la adquisición por 5 puntos de tiempo más. Nota: La fluorescencia verde debe desaparecer progresivamente.</li>
		<li>Pausar la adquisición, inyectar 1,2 ml de DMEM completo de pH 9,5 para lograr un pH 7,4 en el medio de cultivo, marcar el evento en el software y reanudar la adquisición por 5 puntos de tiempo más. Nota: La fluorescencia verde debe reaparecer en la membrana plasmática.</li>
		<li>Analizar imágenes. La Figura 2 muestra imágenes representativas obtenidas con dicho protocolo con el constructo pHluorin-plexinA1.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. En ovo Electroporación De pHluorin-plexinA1 Constructo
<ol><li>Manipulación de huevos antes de la electroporación:<ol>
<li>Guarde los huevos fertilizados en una nevera a 14 °C hasta una semana antes de la incubación.</li>
		<li>Incubar los huevos a 38,5 °C (101,3 °F) en una incubadora con humedad saturada durante 50-52 horas hasta que los embriones alcancen el estadio HH1412. Nota: Los huevos deben colocarse horizontalmente durante la incubación para que el embrión esté correctamente posicionado para la electroporación, flotando en la parte superior de la yema. El estadio HH14 es adecuado para obtener la expresión de los plásmidos en neuronas diferenciadas de la médula espinal y en el ganglio de la raíz dorsal con una tasa de supervivencia adecuada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriones electropolados8-10:<ol>
<li>Preparar la electroporación:<ol>
<li>Preparar plásmidos de ADN libres de endotoxinas con una concentración superior a 2 μg/μl, para poder diluirlos como la concentración deseada.</li>
			<li>Tire de suficientes capilares de vidrio para inyectar las diferentes soluciones de ADN.</li>
			<li>Preparar PBS estéril (-Ca2+; -Mg2+)- 100 U/ml de penicilina/estreptomicina y equilibrar a 38,5 °C.</li>
			<li>Esterilizar la capucha, tijeras curvas y fórceps finos.</li>
			<li>Controle el espaciamiento del electrodo. Nota: Generalmente se utiliza un espacio de 4 mm entre los electrodos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ventana el huevo13 (Figura 3A):<ol>
<li>Use tijeras curvas para perforar la cáscara en el lado romo del huevo.</li>
			<li>Retire 2 ml de albúmina con una aguja de 0,9 mm x 25 mm y una jeringa de 5 ml. Oriente la aguja verticalmente para evitar dañar el saco vitelino.</li>
			<li>Cubra la parte superior del huevo con cinta adhesiva para mantener la integridad de la cáscara.</li>
			<li>Usando tijeras curvas, perfore la cáscara en el centro de la cinta para igualar la presión al retirar 2 ml de albúmina del huevo. Luego, corte una ventana lo suficientemente grande como para visualizar el embrión y poder trabajar en él.</li>
			<li>Añadir ~2 ml de PBS caliente estéril (-Ca2+; -Mg2+)- 100 U/ml de penicilina/estreptomicina para evitar la deshidratación del embrión y hacerlo más accesible al manipulador.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inyectar ADN y electropórate el embrión<ol>
<li>Diluir el plásmido en PBS (-Ca2+; -Mg2+)a una concentración entre 0,5-2 μg/μl y añadir colorante verde rápido para alcanzar una concentración final del 0,025%. Cargue la mezcla de ADN en un capilar. Se recomienda el uso de un inyector. Nota: Compruebe que la resistencia capilar no es demasiado grande (lo que significa que podría haber dificultades al inyectar embriones) ni demasiado pequeña (lo que significa que el capilar podría ser demasiado grande y podría dañar el embrión). Además, la concentración de ácidos nucleicos superior a 2 μg/μl puede causar efectos inespecíficos y debe controlarse.</li>
			<li>Perfore el saco vitelino y el tubo neural en el lado caudal con el capilar cargado. Ingrese al tubo neural con un ángulo poco profundo y llene el lumen desde la cola hasta la cabeza con la mezcla de ADN (Figura 3B). Nota: El verde rápido permite controlar la precisión de la inyección.</li>
			<li>Coloque rápidamente los electrodos de platino de 4 mm a cada lado del tubo neural en el nivel que desea electroborrar y aplique 3 pulsos a 31 V durante 50 milisegundos con intervalos de 500 milisegundos(Figura 3C). Nota: Evite colocar los electrodos en el corazón o en grandes vasos embrionarios adicionales para evitar dañar el embrión en desarrollo. Las burbujas deben formarse en los electrodos.</li>
			<li>Con la aguja, retire 2 ml de albúmina para disminuir el nivel en la cáscara.</li>
			<li>Selle la ventana y el lado romo herméticamente con cinta adhesiva.</li>
			<li>Volver a colocar los huevos a 38,5 °C en la incubadora hasta que alcancen la etapa deseada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Incrustación de embriones y criosección
<ol><li>48 horas después de la electroporación, cosechar cuidadosamente embriones electroporados (etapa HH24). Cortar la cinta y la mitad de la membrana corioallantoidea. Para evitar que los embriones se hundan en la yema, coloque un colador debajo del embrión y corte la segunda mitad de la membrana corioallantoidea.</li>
	<li>Transfiera el embrión a un plato de disección lleno de PBS helado.</li>
	<li>Compruebe la eficiencia de la electroporación buscando fluorescencia en el tubo neural con un microscopio estéreo de fluorescencia. Nota : La coelectroporación de un plásmido control que codifica la RFP puede ayudar a visualizar el área electroporada.</li>
	<li>Diseccione embriones usando un microscalpel para seleccionar el área electroporada de la médula espinal.</li>
	<li>Transferir embriones disecados a una placa de 24 pozos y fijar en pH 7,4 4% Paraformadehído (PFA) - Tampón Fosfato Salino (PBS), O/N a 4 °C. Nota: La etapa de fijación es crucial para permitir la estabilización de pHluorin en su conformación "viva" y así poder utilizar pHluorin en tejido fijo/permeabilizado. Aunque la fijación retarda drásticamente el cambio dependiente del pH de la fluorescencia, se debe tener en cuenta que los cambios conformacionales /protonación todavía pueden ocurrir después de la fijación. Así, el siguiente protocolo (incrustación, criosecciones y observación) debe realizarse dentro de los 3 días posteriores a la etapa de fijación, con todos los tampones a pH 7. Si no se requiere fijación, se recomienda realizar la observación en secciones de tejido vivo.</li>
	<li>Eliminar el 4% de PFA y lavar los embriones en pH 7,4 PBS.</li>
	<li>Incubar embriones en PBS-15% sacarosa y conservar a 4 °C hasta que los embriones se hundan.</li>
	<li>Incubar embriones fijos en pH 7.4 7.5% gelatina- 15% sacarosa durante 45 min a 37 °C para que los embriones estén completamente incrustados.</li>
	<li>Coloque los moldes de incrustación sobre hielo y agregue 400 μl de pH 7.4 7.5% gelatina- 15% sacarosa para lograr una base sólida de 2 mm.</li>
	<li>Aspirar el embrión incrustado con una punta cortada y colocar el embrión sobre la base de gelatina sólida.</li>
	<li>Cubrir con pH 7,4 gelatina al 7,5%, sacarosa al 15% y colocar el embrión con fórceps antes de que la gelatina se solidifique.</li>
	<li>Una vez que la gelatina sea sólida, prepare un baño de isopropanol de -40 °C (use hielo seco o nitrógeno líquido) y congele el bloque de gelatina durante 5 min.</li>
	<li>Mantenga los bloques congelados a -80 °C.</li>
	<li>Coloque el bloque congelado a -20 °C durante 1 hora.</li>
	<li>Retire el molde y fije el bloque en un mandril con un medio de polietilenglicol.</li>
	<li>Una vez que el bloque esté bien fijado, coloque el mandril en el sistema de criostato. Nota: Use portaobjetos recubiertos para evitar la pérdida de tejido durante la tinción.</li>
	<li>Realizar criosecciones seriales (generalmente se realizan criosecciones de 20 μm).</li>
	<li>Deje secar las criosecciones durante 15 min en rt. Nota: las criosecciones deben protegerse de la exposición innecesaria a la luz para evitar el blanqueo de la fluorescencia de GFP.</li>
</ol>5. Análisis microscópico de criosecciones
<ol><li>Rehidratar criosecciones en pH 7,4 PBS a RT durante 10 min. Nota: Si es necesario, los núcleos se pueden teñir con Hoechst.</li>
	<li>Utilizar una solución de Hoechst de 0,5 μg/ml en PBS e incubar criosecciones durante 15 min.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos 3x con pH 7.4 PBS durante 5 min.</li>
	<li>Proceda al montaje por deslizamiento. Se puede utilizar una solución de montaje de alcohol polivinílico de pH 7.4 (o más básico) que endurece la O/N: coloque cuidadosamente el cubrebocas para evitar la formación de burbujas de aire entre la corredera y la cubierta.</li>
	<li>Deje que el medio de montaje se endurezca O/N a 4 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Utilice un microscopio confocal invertido para visualizar con precisión la proteína de fusión pHluorin-plexinA1: realice z-stack a la resolución óptima de agujeros de alfiler y óptico y utilice lentes 20X (NA 0.75) o 40X (NA 1.3). Nota: pHluorin es detectable con los mismos parámetros utilizados para detectar GFP(es decir, pico de emisión a 509 nm). Los ajustes del filtro de excitación y detección de longitud de onda se definen de forma óptima mediante el software de imágenes. Hoechst se detecta entre 425-460 nm (la excitación está a 405 nm), GFP o pHluorin se detecta entre 485-545 nm (la excitación está a 473 nm) y la RFP se detecta entre 575-675 nm (la excitación está a 559 nm).</li>
</ol>Las imágenes representativas de la expresión de pHluorin-plexinA1 y eGFP en la médula espinal del embrión de polluelo se muestran en la Figura 4.

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<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li>
<li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li>
<li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHTomato%2C+a+red%2C+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li>
<li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para seguir la dinámica de un receptor de guía de axones tanto en cultivo celular como en el contexto de desarrollo de la médula espinal del embrión de polluelo.
Para diseñar una proteína etiquetada con pHluorin de novo, es necesario considerar dos puntos con respecto a la estrategia de clonación. En primer lugar, la etiqueta de pHluorin debe exponerse a la luz de los endosomas ácidos y, en consecuencia, al compartimento extracel...

Durante su navegación, los axones integran múltiples señales ambientales que los guían hacia su objetivo. Estas señales activan los receptores de guía en la superficie de los terminales de los axones, los conos de crecimiento, que a su vez inician una vía de señalización adecuada. Por lo tanto, la regulación temporal y espacial de la distribución de la superficie celular de los receptores es fundamental para establecer la sensibilidad del cono de crecimiento1. En este contexto, el cruce de la línea media por axones comisurales es un excelente modelo para investigar la regulación de los niveles de superficie celular del receptor. En la médula espinal en desarrollo, los axones commissurales son inicialmente atraídos hacia la placa del piso ventral donde cruzan la línea media. Después del cruce, pierden su capacidad de respuesta a los atrayentes de la placa del piso y ganan respuesta a los repelentes de la placa del piso para que puedan salir de la placa del piso y navegar hacia su destino final en el lado contralateral del sistema nervioso2,3. La regulación de la disponibilidad del receptor en la superficie del cono de crecimiento es uno de los mecanismos subyacentes al cambio de capacidad de respuesta a las señales de la línea media4,5. Por lo tanto, la monitorización selectiva de los receptores presentes en la membrana plasmática de los conos de crecimiento es de primordial importancia. Se describe aquí un método basado en la propiedad de fluorescencia dependiente del pH de una proteína fluorescente verde (GFP) variante para visualizar específicamente los receptores de guía axón que se dirigen a la membrana plasmática in vitro e in vivo,en el desarrollo de la médula espinal polluelo.
Rothman y sus colegas diseñados por mutaciones puntuales variantes sensibles al pH de GFP, incluida la eclíptica pHluorin6. La pHluorgina eclíptica tiene la propiedad de ser no fluorescente cuando se expone al pH ácido (<6), mientras que es fluorescente a pH neutro. Esto permite distinguir los receptores no fluorescentes localizados en compartimentos ácidos intracelulares(es decir, endosomas, vesículas de tráfico) de los receptores fluorescentes incorporados a la membrana plasmática y, por lo tanto, expuestos al pH neutro extracelular7. Aprovechamos esto para monitorizar la localización de la membrana plasmática de plexinA1, un receptor de guía axón que media la respuesta del cono de crecimiento a la semaforina repelente de línea media 3B5 (Figura 1A). Se describe aquí la caracterización in vitro de una construcción de pHluorin-plexinA1, junto con en ovo electroporación8-10 de esta construcción en la médula espinal polluelo en desarrollo seguido por el análisis microscópico de criosecciones que permiten seguir la dinámica del receptor de orientación axón in vivo con resoluciones espaciales y temporales.

<table><tbody><tr><td>Células COS7</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>GIBCO</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>GIBCO</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Exgen500</td><td>Euromedex Fermentas</td><td>ET0250</td><td></td></tr><tr><td>PBS -Ca2+ -Mg2+</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Colorante verde rápido</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>32% Solución acuosa de paraformaldehído</td><td>Microscopía</td> electrónica <td>15714-S</td><td>Diluir extemporáneamente en PBS para lograr una solución al 4% Gelatina</td></tr><tr><td>de agua fría piel de pescado</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cryomount</td><td>Histolab</td><td>00890</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Invitrogen</td><td>H21486</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Fluka</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plato de vidrio inferior de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-05S Agujas</td><td></td></tr><tr><td>0,9 mm x 25 mm</td><td>Terumo</td><td>NN-2025R</td><td></td></tr><tr><td>Capilares</td><td>CML</td><td>PP230PO</td><td>capilares se estiran manualmente en la llama</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td><td>FST</td><td>129-10</td><td></td></tr><tr><td>Microbisturí</td><td>FST</td><td>10316-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td>FST Dumont #5 REF#11254</td><td></td></tr><tr><td>Equipo/software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de lapso</td><td>de tiempo Zeiss</td><td>Observer 1</td><td></td></tr><tr><td>Módulo temporal S</td><td>PECON para Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 módulo S</td><td>PECON para Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Metamorph Incubadora</td> de huevos <td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sanyo</td><td>MIR154</td><td></td></tr><tr><td>Aparato electroporador</td><td>Nepa Gene CO., LTD</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos</td><td>Nepa Gene CO., LTD</td><td>CUY611P7-4</td><td>Electrodos de platino de 4 mm</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de fluorescencia</td><td>LEICA</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>MICROM</td><td>HM550</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000, X81</td><td></td></tr><tr><td>Software Fluoview</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC Software Main Workbench</td><td>CLC Bio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso de phluorin para evaluar la dinámica de los receptores de orientación axón en el cultivo celular y en el embrión de polluelo

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Durante el desarrollo, los receptores de guía de axones juegan un papel crucial en la regulación de la sensibilidad de los axones a las señales atractivas y repulsivas. De hecho, la activación de los receptores de guía es el primer paso de los mecanismos de señalización que permiten que las puntas de los axones, los conos de crecimiento, respondan a los ligandos. Como tal, la modulación de su disponibilidad en la superficie celular es uno de los mecanismos que participan en el establecimiento de la sensibilidad del cono de crecimiento. Describimos aquí un método para visualizar exacto la dinámica espacio-temporal de la superficie de la célula de un receptor de la dirección del axón in vitro e in vivo en la médula espinal del polluelo que se desarrolla. Aprovechamos la propiedad de fluorescencia dependiente del pH de una variante de proteína fluorescente verde (GFP) para detectar específicamente la fracción del receptor de guía de axones que se dirige a la membrana plasmática. Primero describimos la validación in vitro de tales construcciones dependientes del pH y detallamos aún más su uso in vivo,en la cuerda espinal del polluelo, para evaluar la dinámica espacio-temporal del receptor de guía de axones de interés.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Figura 1. A. Esquema de las propiedades de fluorescencia pHluorin-plexinA1 en un contexto celular. La PHluorin es no fluorescente en compartimentos intracelulares donde el pH es ácido (<6) como en vesículas de tráfico o en endosomas y es fluorescente cuando se expone al medio extracelular donde el pH es neut...

Se describe aquí el uso de una variante de proteína fluorescente verde sensible al pH, pHluorin, para estudiar la dinámica espacio-temporal de los receptores de guía de axones que se trafficking en la superficie celular. El receptor marcado con pHluorin se expresa tanto en cultivo celular como in vivo,utilizando la electroporación del embrión de pollito.

Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una variante de GFP sensible al pH para estudiar la dinámica espacio-temporal del tráfico de receptores guía de axones en la superficie celular. Esto se logra marcando primero el receptor de interés con la secuencia de Florin utilizando una estrategia de clonación adecuada. El segundo paso del procedimiento es caracterizar la sensibilidad al pH del receptor marcado con Florin transfectado in vitro.El tercer paso es electroporar la construcción del receptor marcado con Florin en OVO para lograr la expresión en la médula espinal. El paso final es seccionar los embriones electroporados en la etapa deseada. En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios en el tráfico de receptores en la superficie celular tanto en dominios espaciales como temporales a través de la microscopía de inmunofluorescencia.La ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de construcciones de proteínas con tecnología GFP, es que la sensibilidad al pH de los receptores de tres alas permite la detección de cambios espacio-temporales de la dinámica de los receptores en la superficie celular, tanto in vitro como in vivo. Este méto

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Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que...

Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

Este ensayo evalúa la capacidad de una molécula de señalización, la proteína morfogenética ósea 7 aquí (BMP7), para reorientar axones de la comisura. Un explante de la médula espinal dorsal de embriones se cultivaron junto a un conjunto de células secretoras de COS los factores de crecimiento candidato. Reorientado axones de la comisura de crecimiento en el explante se visualizan mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Ensayo de la capacidad de difusible moléculas de señalización para reorientar embrionarias axones de la comisura espinal

Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

Un método por el cual la expresión de genes en el tubo neural puede ser regulada hacia abajo en un tipo de células específicas, de manera detectable se describe. Demostramos...

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

Mediante el etiquetado de los dominios extracelulares de los receptores de membrana con pHluorin superecliptic, y por imágenes de estos receptores de fusión en las neuronas de ratón en cultivo, se puede visualizar directamente los eventos de inserción individuales vesiculares de los receptores a la membrana plasmática. Esta técnica será fundamental para elucidar los mecanismos moleculares que regulan la inserción del receptor en la membrana plasmática.

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

Describimos un protocolo para el marcaje in vivo de neuronas sensoriales olfativas mediante electroporación y posterior escaneo láser confocal o microscopía multifotónica para visualizar la morfología neuronal y su desarrollo a lo largo del tiempo.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología En Vivo

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Aprende a utilizar pHluorin para evaluar la dinámica de receptores de orientación axónica en cultivos celulares y embriones de pollo mediante electroporación in vivo. Este método permite visualizar el tráfico receptor en tiempo real.

Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo (Video) | JoVE Journal

Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo

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