Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y medir directamente las características de las chispas de calcio en las fibras musculares esqueléticas intactas. Esto se logra aislando primero las fibras musculares intactas del flexor corto de un solo dedo de un ratón. A continuación, la fibra muscular se carga con un tinte sensible al calcio para detectar las chispas de calcio.

El paso final es registrar las chispas y analizar los datos. En última instancia, las imágenes basadas en microscopía confocal se utilizan para detectar transitorios de calcio inducidos por estrés osmótico transitorio. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave en el campo de la fisiología muscular sobre el mecanismo que conduce a la distrofia del músculo esquelético y al proceso de envejecimiento muscular.

Por lo tanto, tendremos dos estudiantes de posgrado, Christine GOPer, y para demostrar la ingesta saludable de aislamiento de fibra FDB y el científico investigador senior, el Dr. Park, para demostrar la perfusión de estrés osmótico y el análisis de datos. Comience la configuración colocando un micromanipulador de tres ejes que sostiene un sistema de perfusión de dos canales. El sistema de perfusión está hecho con barriles de jeringa de señuelo desechables con señuelo de tres vías adjunto.

Las llaves de paso de bloqueo cargan un canal del sistema de perfusión con solución tirotónica isotónica y cargan el otro canal con solución tirotónica hipotónica. Después de sacrificar a un ratón, use tijeras de disección gruesas para quitar el pie cortando la pierna por encima de la articulación del tobillo. Coloque el pie en una cámara de disección llena de una solución mínima de calcio.

Sujete el pie a la cámara con la superficie de la maceta hacia arriba. Diseccionar el músculo flexor corto de los dedos o FDB exponiendo y cortando el tendón. A continuación, tire suavemente del tendón para separar el músculo del tejido circundante.

Encuentre dónde se ramifica el tendón distal en dedos individuales en las capas profundas del músculo y corte el tendón distal en ese lugar. Agarre los tendones con pinzas y transfiera el músculo FDB a un tubo con una alícuota descongelada de solución de digestión de colagenasa Precaliente a 37 grados centígrados. Incubar el tubo que contiene el FDB en posición vertical en un agitador orbital a 37 grados Celsius durante 60 a 90 minutos con una velocidad de 160 RPM después de la incubación, transfirió el FDB digerido a un tubo con 700 microlitros de solución tirotónica isotónica.

A continuación, utilice una hoja de afeitar limpia para quitar las puntas de tres o cuatro micropipetas de 200 microlitros para crear puntas de micropipeta de diámetro gradualmente decreciente con una punta de pipeta de 200 microlitros sin cortar como diámetro más pequeño. Ahora, comenzando con la punta de micropipeta de mayor diámetro, extraiga el músculo FDB a través de la punta de la micropipeta. Repita esta acción varias veces.

A continuación, cambie a la micropipeta con la siguiente punta de diámetro más pequeño y pase el músculo varias veces a través de esa punta. Las fibras rotas no se pueden utilizar para este protocolo, por lo que es importante no digerir demasiado o poco las fibras y asegurarse de no forzarlas a través de las puntas de las micropipetas demasiado pequeñas y abiertas. Continúe a través de la serie hasta que se haya utilizado la punta de diámetro más pequeño para evitar dañar las fibras.

Cada punta debe ser lo suficientemente grande como para permitir que el haz de fibras pase sin pegarse. Este proceso dura aproximadamente 10 minutos y finaliza cuando las fibras FDB individuales son visibles. A continuación, después de golpear suavemente y volver a suspender las fibras FDB en el tubo, utilice una micropipeta cortada de 200 microlitros para transferir 70 microlitros al centro de una placa delta TPG de 35 milímetros que contenga un mililitro de solución isotónica de tiro.

A continuación, utilice un microscopio de disección para determinar el número de fibras individuales intactas en la placa. Agregue alícuotas adicionales de fibras FDB si es necesario para obtener de tres a cuatro fibras intactas en el plato. El resto de las fibras musculares aisladas pueden almacenarse a cuatro grados centígrados para su uso en seis horas.

Para la deshidratación, transfiera 500 microlitros de solución isotónica de tiro del plato con fibras FDB plateadas a un tubo con 10 microlitros de caldo de gripe a las 4:00 a.m. Después de mezclar, transfiéralo nuevamente al plato para obtener una concentración final de 10 micromolares a las 4:00 a. m. Deje que las fibras musculares se descarguen durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad después de una hora.

Retire con cuidado 500 microlitros de solución isotónica para la gripe a las 4:00 a.m. que contiene tirotónica en tres lotes con una punta de micropipeta de 200 microlitros sin cortar. A continuación, añada un volumen igual de solución isotónica fresca. Repite este lavado tres veces más.

Transfiera la placa al microscopio confocal y seleccione una fibra intacta con estrías claras y una membrana leal lisa de Sarco para la experimentación. Utilice los controles del micromanipulador para colocar la punta del sistema de perfusión, a una distancia de 400 a 500 micras de la fibra muscular objetivo y fuera del centro de la fibra muscular. Comience el flujo de la solución isotónica Tyro para asegurarse de que la fibra FDB permanezca en su lugar.

Si la fibra no permanece en su lugar, ubique otra fibra en el plato y vuelva a colocar la punta del sistema de perfusión usando un objetivo de inmersión en aceite de 40x. Excite la gripe a las 4:00 a.m. con un láser de argón y registre las señales de emisión. Recopile una línea de base para los experimentos de estrés osmótico perfundiendo las fibras con una solución isotónica durante 60 segundos.

A continuación, cambie a una solución hipotónica de Tyro durante 100 segundos para inducir la hinchazón, seguido de un retorno a la solución isotónica de Tyro durante al menos 10 minutos. Generalmente, solo se aplica un choque osmótico a una sola fibra intacta en una placa delta TPG. A lo largo del experimento de estrés osmótico.

Registre la localización espacial de las chispas de calcio como se describe en el protocolo de texto. A continuación, busque una nueva fibra en una nueva placa y repita el protocolo de choque osmótico para inducir el calcio transitorio. Recopile un gran número de trazas de escaneo de línea XT para evaluar la morfología y la cinética de los parámetros individuales de la chispa de calcio.

Un algoritmo desarrollado a medida es útil para análisis que requieren la identificación manual de regiones de interés en algunos modelos de enfermedades musculares. Alternativamente, el maestro de chispas disponible públicamente en la imagen J se puede utilizar para definir las propiedades cinéticas de las chispas de calcio y su distribución espacial en el músculo esquelético. Una fibra muscular FDB esquelética se trató primero con una solución isotónica de tiro, luego se trató con una solución de tiro hipotónica y luego se trató con una solución isotónica de tiro.

Aquí se muestra un histograma de los episodios de chispas observados con imágenes XY a medida que la fibra muscular se encoge hasta el volumen original. Se observa una respuesta robusta de chispa de calcio directamente debajo del sarcolema de la fibra muscular. La piel de la línea confocal mostrada por la línea discontinua roja se coloca justo debajo de la membrana ammal Sarco de la fibra muscular.

El estrés osmótico evoca discretas chispas de calcio, que se presentan en modo de escaneo lineal o XT. El análisis de chispas con nuestro algoritmo de ajuste de chispas desarrollado a medida demuestra la intensidad de calcio, que es proporcional al flujo de liberación de calcio SR, y también demuestra la cinética o la duración de las chispas. Un gráfico tridimensional de la imagen de escaneo de cuatro líneas de la gripe muestra las chispas evocadas por el estrés osmótico en modo espacio-temporal y se muestran sus intensidades.

A continuación, se muestran escaneos lineales o imágenes XT de chispas de calcio derivadas de fibras musculares FDB jóvenes y sanas, chispas de fibras musculares FDB envejecidas y chispas de fibras musculares FDB jóvenes y distróficas de ratones MDX. Obsérvese la señal reducida que se produce en las fibras musculares envejecidas, mientras que las fibras musculares MDX jóvenes mostraron chispas de calcio robustas. Aquí se muestran las chispas de calcio de los músculos EDL de tipo salvaje junto con el marcado TMRE de las mitocondrias.

Las imágenes muestran la transitoriedad antes y después de los cambios de presión osmótica. Aquí se muestran las chispas de calcio de una esclerosis lateral miotrófica o de los músculos LS. Tenga en cuenta que las áreas con mitocondrias dañadas, es decir, con baja señal de TMRE, aún albergan chispas de calcio robustas.

Por lo tanto, la parte más difícil de este procedimiento es poder obtener fibras musculares sanas y de buena calidad, y también debe poder tener un sistema de perfusión que le permita cambiar la solución de manera eficiente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la fibra muscular aislada para medir la chispa de calcio, que son las unidades elementales para el músculo esquelético que libera calcio. Y estos eventos de liberación de calcio ciertamente se pueden usar como un biomarcador para evaluar el estado saludable del músculo y las muchas condiciones fisiopatológicas como el envejecimiento muscular, la diabetes o la distrofia muscular.