Name: Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprende a realizar registros electrofisiológicos in vivo en el cerebro de peces cebra adultos intactos mediante inmovilización, intubación y craniotomía. Este método permite estudiar la actividad neural en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH / NINDS subvención R01NS070159 (a TMD, JDL y ATS).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y siguieron el protocolo # A2011 09-003, que fue revisado, aprobado y supervisado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y Uso Comité. 1. Configuración del equipo <ol><li> Sistema de perfusión para la craneotomía Inmovilización del adulto requiere un sistema de intubación para entregar oxígeno disuelto a los peces. Una variedad de sistemas puede ser utilizado, pero se utiliza un sistema de gravedad simple que consiste en una jeringa de 60 ml. Elevar la presión de la cabeza a una altura que produce consistentemente una velocidad de flujo de 1 ~ ml / min. Esta jeringa se puede colocar en serie con las jeringas que luego se utilizan para el sistema de perfusión electrofisiológico. <ol><li> Obtener una 60 ml Luer del tubo de la jeringa de bloqueo y retire el émbolo. </li><li> Suspender la jeringa aproximadamente 8 in &amp;º 160, por encima de la base de un anillo-soporte mediante una abrazadera. </li><li> Conectar una llave de paso de un solo sentido para el extremo de la jeringa. Para el extremo opuesto de la llave de paso, conectar una pieza de tubo, 2 mm de diámetro, que es lo suficientemente largo como para extenderse a la base de la intubación. </li></ol></li><li> Sistema de perfusión para electrofisiología Para los experimentos electrofisiológicos, a menudo es necesario introducir una gran variedad de compuestos durante el curso de un experimento. Una variedad de sistemas están disponibles, pero un sistema de gravedad que consiste en 60 ml de jeringas en serie puede ser utilizado. Esta configuración permite una introducción simple, serie de soluciones que se llevarán a cabo mediante la apertura de la llave de paso correspondiente. <ol><li> Obtener dos o más 60 ml Luer jeringas de bloqueo y quite los émbolos de cada uno. Se requiere una jeringa para administrar agua hábitat para los peces, mientras que cada tubo subsiguiente se puede utilizar para administrar una variedad de compuestos farmacológicos para los peces. </li><li> Conecte cada jeringa a un 3 -manera llave de paso con una conexión Luer. </li><li> Utilice ⅛ en diámetro exterior del tubo (OD) para conectar las jeringas en serie con un bloqueo Luer macho en un extremo. </li><li> Asegure el dispositivo de tal manera que el cabezal de presión se eleva a una altura de 27 en encima de la base, o una altura que produce consistentemente un caudal de 1 ~ ml / min. </li></ol></li><li> Cánula de intubación La cánula de intubación facilita la introducción de fluido a los peces. Esta configuración proporciona la flexibilidad y la firmeza a la mejor posición de la cánula dentro de la boca del animal. <ol><li> El uso de cualquier par de tijeras en general (por ejemplo,. Fiskars) o una hoja de afeitar, quitar una sección de 1,5 cm desde el extremo ancho de una punta de pipeta P-200. </li><li> Inserte un trozo de tubo mm 6 cm x 1 en una válvula reductora con un tapón hembra Luer lock y la férula de silicona, es decir, un adaptador Tuohy Borst, e insertar esta cánula en la punta de la pipeta modificado. Sostenga la punta de la pipeta en posición con el Luer lock utilizando una corta porción de ⅛ en tubo de diámetro. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1.jpg" /> Figura 1 </li></ol></li><li> Base de intubación Este plato es utilizado para sostener el animal inmovilizado en una posición estable, en posición vertical y para facilitar la eliminación del fluido que entra en el animal a través de la intubación. Si esto no se ha establecido correctamente, se puede producir la puesta en común, lo que lleva a las señales vibratorias intrusivos en el registro electrofisiológico. <ol><li> Obtener el plato de base de un 100 mm x 15 mm placa Petri de plástico. </li><li> Utilizando una herramienta de soldadura, fundir un agujero, 6 mm de diámetro y 7,5 mm por debajo del borde de la llanta, en el lado del plato. Utilizando la misma herramienta, fundir un agujero, 10 mm de diámetro y 11 mm por debajo del labio del plato ~ 74 ° en sentido antihorario desde el<html> agujero más pequeño. Este agujero servirá como el orificio de drenaje. </li><li> Inserte un tubo, 1 cm de diámetro, en el agujero con el extremo levantado de tal manera que al final no puede ser bloqueada. A continuación, inserte una punta P-200 pipetteman en el pequeño orificio, lo que servirá como una cánula maniquí. </li><li> Con la placa de Petri ligeramente elevada en el lado del agujero más grande, se vierte la cera fundida enlatado en el plato de manera que el orificio de la cánula quede cubierto. La región servirá como un tope, lo que permite la cánula que se inserta ~ 3 mm en la boca de los peces. Esta puesta en marcha se debe permitir que se solidifique. </li><li> El uso de un borde de metal de llama calentado, tallar un canal para mantener el pescado de manera que el canal comienza a partir de la punta de la cánula y se extiende aproximadamente 1-2 pulg <ol><li> Se debe tener cuidado para asegurar que se forma un ángulo hacia abajo continua de la zona de cánula al puerto de drenaje.065fig2.jpg &quot;width =&quot; 400px &quot;/&gt; Figura 2 </li></ol></li></ol></li><li> Configuración de perfusión <ol><li> Antes de empezar, limpiar las perfusión set-ups con agua del hábitat, lo que garantiza que se eliminen todas las burbujas de aire. </li><li> Añadir ~ 30 ml de 0,016% (630 mM) solución tricaína a la configuración de la perfusión craneotomía y permiten ~ 2 ml a ejecutar a través de la tubería para asegurar que tricaína será entregado al animal tras el inicio de la perfusión. Ver el paso 2.2 de dilución. </li><li> Para la configuración principal de perfusión, agregue ~ 50 ml de agua de hábitat al primer tubo. Añadir todos los compuestos experimentales deseados a cada uno de los tubos restantes. </li><li> Coloque la configuración cánula en el pequeño orificio de la base de la intubación. </li><li> Gire un 1 en toda la franja de 42 cm Kimwipe en un espiral apretado y la inserta en el tubo de drenaje de forma que el Kimwipe extiende en ambos extremos. Este tejido servirá como una mecha para eliminar el líquido perfundido y para evitar la acumulación de fluido dentro de tque la intubación de base, lo que podría interferir con el registro electrofisiológico. </li><li> Inserte un extremo del tubo en el orificio grande de la placa de Petri, permitiendo que el extremo inferior de extender en un plato inerte que es lo suficientemente grande como para recoger todos los residuos de la perfusión. Este plato será el depósito de salida para la configuración. Coloque el tejido de manera que un extremo se encuentran cerca de la región del abdomen del animal y la extensión inferior puede gotear en el plato. </li><li> Coloque esta base de intubación completado cerca del microscopio de disección. Conectar el cierre Luer de la cánula para el tubo de perfusión tricaína. </li></ol></li><li> Capilar de la aguja y electrodos <ol><li> Obtener un electrodo primario que consiste en 2,5 en la de 0.010 en hilo de plata y un electrodo de secundaria que debe ser formada por 15 en el mismo cable a tierra a la instalación. Para el electrodo secundario, utilizar un 15 en la sección de 0,010 en alambre de plata con una punta soldada, que permite que quepaen la parte trasera de una etapa de la cabeza. <ol><li> Electrochapa las puntas de ambos los alambres de plata primaria y secundaria con los iones de cloruro. </li><li> El uso de un extractor de micropipeta, tire un borosilicato aguja capilar de pared delgada con una resistencia de &lt;15 mΩ. <ol><li> Llenar la aguja capilar con 2-3 l de 2 M de cloruro de potasio, o lo suficiente para cubrir parcialmente la punta cloruro recubierto de alambre de plata. </li><li> Inserte el electrodo primario en la cabeza del capilar y montarlo en el soporte del electrodo. </li><li> Monte la etapa de la cabeza en un micromanipulador y luego montar el electrodo secundario en un segundo micromanipulador. Con la instalación, la primera posición de cada electrodo y luego coloque la punta del electrodo de soldadura secundaria en la parte posterior de la etapa de la cabeza. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparación de las soluciones, sistema de perfusión, y electrofisiológico Equipo de grabación <ol><li> Obtener 1 L de agua hábitatdel acuario de los peces. </li><li> 0,016% T] metanosulfonato de tricaína (tricaína) (50 ml de 630 mM) 24. <ol><li> Descongelar una alícuota de 0,4% tricaína tamponada con Tris, pH 7,2. </li><li> Añadir 2,1 ml de 0,4% tricaína Tris-buffer a 47,9 ml de agua del hábitat y mezclar. </li></ol></li><li> Descongele concentración madre de deseado compuesto experimental soluble en agua (por ejemplo pentilentetrazol 300 mM, un chemoconvulsant común). </li><li> Descongelar una alícuota de 1 mg / l bromuro de pancuronio en solución de Ringer. </li><li> Llenar ambos sistemas de intubación experimentales con agua y hábitat anestesiante y drene por lo menos lo suficiente como para eliminar todas las burbujas de los tubos. Esto debe hacerse porque las burbujas obstruyen el flujo de fluido, que conduce a la asfixia del animal. <ol><li> Vaciar completamente los tubos de perfusión que sostendrán los medicamentos sin permitir que el aire en el tubo de conexión. </li><li> Llene el tubo anestesiante con 0,016% (630 M) solución tricaína y colocar cualquier expercompuesto imental (s) en el tubo adicional (s) en el sistema de perfusión experimental. <ol><li> El primer tubo de perfusión experimental debe contener sólo agua del hábitat. </li></ol></li></ol></li><li> Humedezca la pequeña esponja de poros con agua hábitat y colocar en un vacío de 60 mm x 15 mm placa de Petri. Este plato se utiliza para mantener a los peces mientras se inyecta el anestésico. </li></ol> 3. Craneotomía <ol><li> Agregar suficiente de la solución tricaína 630 M a un 15 x 60 mm placa de Petri para llenarlo aproximadamente tres cuartas partes del camino. Pesar el plato lleno. Esto se utiliza para inmovilizar el animal para que otros anestesia pueden ser inyectados por vía intraperitoneal. </li><li> Sumerja el animal en el plato que contiene tricaína y pesarlos de nuevo. <ol><li> Restar la diferencia entre los pesos de los pasos 1 y 2 para obtener el peso de los peces. </li><li> Permita que el animal permanezca en la solución tricaína hasta la calma y la mayor movimiento ha cesado. </li></ol></li><li> Con un par de pinzas grandes, traslado a los peces a la esponja prehumedecido y posicionar lateralmente. Transferencia de los peces por la cola funciona bien para este proceso. <ol><li> Coloque la esponja y los peces bajo el microscopio de disección. </li></ol></li><li> Con una jeringa Nanofil que contiene una aguja 34, mida lo suficiente bromuro de pancuronio tal que no es 1 g / g de peso del pez. </li><li> El uso de un palito de paleta a lo largo de la parte dorsal de los peces a mantenerla firme, administrar el bromuro de pancuronio intraperitoneal utilizando la jeringa Nanofil. </li><li> Usando las pinzas finas, coge el pez por la mandíbula y rápidamente transferir el animal a la base de la intubación. </li><li> Coloque el animal de modo que es dorsal-up en la forma de cera y de tal manera que la cánula 1 mm puede ser insertado en la boca. Utilice las pinzas finas para maniobrar el pescado y abrir la boca alrededor de la cánula. Debido a la composición de la bandeja de intubación, una parada se diseñó en la base, permitiendo que elcánula que se inserta 3 mm en la boca de los peces. <ol><li> Una vez en posición, encienda el tubo de perfusión por gravedad que contiene tricaína. </li></ol></li><li> Corte una sección de 3 cm2 de tejido Kimqipe y mojarlo con agua del hábitat. <ol><li> Coloque el tejido sobre el animal para evitar la desecación. La sección Kimwipe también puede ser posicionada para ayudar en la sujeción del animal dorsal plano. </li></ol></li><li> Bajo el microscopio de disección, utilice tijeras de primavera vanna para eliminar ~ 2 mm 2 sección del cráneo que cubre el techo óptico. Esta zona parece un plato oscuro y huesudo que se sienta detrás del ojo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3.jpg" width="400px" /> Figura 3 <ol><li> Inserte una hoja de la tijera vanna en el borde de la placa y empujar con la fuerza suficiente para la penetraciónte El hueso, sin perforar el cerebro. Cierre las tijeras para cortar el hueso. </li><li> Retire el trozo de hueso. </li><li> Si nada de sangre está presente, retire con el borde de un Kimwipe. El sangrado por lo general se detiene poco después de la realización de la craneotomía. </li></ol></li></ol> 4. Electrofisiología <ol><li> Cierre la llave de paso de la intubación y rápidamente desconectar el bloqueo Luer que conecta la base a la intubación por goteo tricaína. <ol><li> Mueva la configuración intubación intacta al microscopio electrofisiología y conectar con el sistema de perfusión. </li><li> Abra el agua y hábitat perfusión a una velocidad de 1 ml / min durante aproximadamente 1 hora, con el fin de lavar el tricaína. </li></ol></li><li> El uso de un micromanipulador bajo control visual, la posición del electrodo secundario de manera que la punta del electrodo se puede insertar en la fosa nasal del animal o en el baño detrás de la mandíbula superior. </li><li> Inserte la aguja del electrodo principal en la apertura craneotomía. Inserte elaguja en el tejido, de tal manera que la punta se posiciona bastante superficial en el techo óptico. <ol><li> Si el electrodo es demasiado profundo, la señal eléctrica puede ser pequeña. </li></ol></li><li> Recopilar y analizar la diferencia eléctrica registrada entre los electrodos de referencia primarios y secundarios. Este proceso permitirá que las grabaciones extracelulares que se obtengan. <ol><li> Recoge los datos en modo-Gap libre a una velocidad de muestreo de 5 kHz, con un filtro de paso bajo de 0.1 kHz y un filtro de paso alto de 1 Hz. </li><li> No comience a grabar la actividad electrofisiológica hasta que el agua del hábitat ha perfundido durante un mínimo de 45 min. </li><li> Grabación de una línea de base de la actividad nativa durante al menos 15 min antes de la adición de fármacos experimentales. Comenzar la perfusión con fármacos experimentales de elección y registro de la cantidad de tiempo deseado. En las preparaciones sanos, es posible grabar la actividad neurológica durante 2-3 h. </li></ol></li></ol> 5. Limpiar </p&gt; <ol><li> Al final del experimento, quitar los electrodos del cráneo y fosa nasal y eliminar la configuración de la intubación. <ol><li> La eutanasia a los animales por sobredosis de drogas utilizando tricaína de acuerdo con las prácticas aceptadas, como se indica por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) Directrices para la Eutanasia de los Animales (2013). </li><li> El pez cebra que ser sacrificados debe ser colocado en una solución tricaína a 200-500 mg / L. Los peces son para ser dejado en la solución durante un mínimo de 10 minutos después de la cesación de la actividad opercular rítmica, después de lo cual se les somete a un medio físico de la eutanasia (transección de cuello uterino) para asegurar la muerte. </li></ol></li><li> Desconecte el bloqueo Luer conexión de la base de la intubación a la configuración de la perfusión. Recoger el líquido residual en el sistema de perfusión para su correcta eliminación. <ol><li> Deje correr el agua desionizada, a través de todos los tubos y recoger para su correcta eliminación, si peligroso. </li></ol></li><li> Para desinfectar el sistema de perfusión, rsin 70% de etanol a través de todos los tubos y recoger para su correcta eliminación. <ol><li> Agregar las llaves de paso para cada tubo en la posición abierta para facilitar el secado de aire. </li><li> Sumerja los electrodos en etanol al 70% y dejar secar al aire. </li></ol></li><li> Deseche la aguja capilar utilizado para el electrodo de primaria en un contenedor de objetos punzantes. </li><li> Desmontar la configuración de la intubación y enjuagar todas las piezas con agua. <ol><li> Limpie cada pieza con etanol al 70% y dejar secar al aire. </li></ol></li></ol>

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<li>Lazarova, M., Samanin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiation+by+yohimbine+of+pentylenetetrazol-induced+seizures+in+rats%3A+role+of+alpha+2+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors.</a> Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).</li>
<li>Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+technical%2C+biological+and+pharmacological+factors+in+the+laboratory+evaluation+of+anticonvulsant+drugs.+III.+Pentylenetetrazole+seizure+models%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+res%22%5BJournal%5D)">The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models.</a> Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).</li>
<li>DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+of+pyrethroid+insecticides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos.</a> Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).</li>
<li>Arnolds, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+effects+of+tricaine+on+the+supramedullary%2Fdorsal+neurons+of+the+cunner%2C+Tautogolabrus+adspersus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus.</a> Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este protocolo se ha usado para medir la actividad neuronal de adultos de pez cebra en vivo. Con la práctica, la actividad neuronal se puede observar constantemente, a pesar de las características (amplitud y la forma de eventos) de la actividad registrada pueden variar entre los peces. La utilización de la técnica de grabación extracelular puede explicar esta observación. El método proporciona control simultáneo de un gran número de células dentro de una región 1, por lo que las variaciones en el po...

En este artículo, un protocolo se describe para la obtención de grabaciones in vivo de la actividad neuronal en adultos de pez cebra. Se utilizan métodos de registro extracelular, proporcionando mediciones de voltaje de actividad eléctrica dentro de una pequeña región de tejido neural. Este método de investigación implica el seguimiento de un gran número de células en un animal de comportarse 1. Anteriormente, las grabaciones de división se han realizado en adultos y larvas, como lo han hecho los preparativos de la taza del ojo y grabaciones electrorretinograma. Estos experimentos se han realizado en gran medida al detalle las respuestas fisiológicas de diferentes sistemas sensoriales 2-5. Hasta hace poco, los preparativos cerebrales intactas sólo han estado disponibles para la realización de electrofisiología con 3,6,7 larva de pez cebra, que se puede producir la difusión de la respiración y el oxígeno a través de la piel. Nuestra preparación permite que la actividad neurológica nativa de un pez cebra adulto a medir mientras el animal sigue siendo plenamente consciente y consciente of sus alrededores. El pez cebra (Danio rerio) actualmente juegan un papel fundamental como modelo para estudios genéticos, toxicológicos, farmacológicos y fisiopatológicos 3. El pez cebra se han ganado visibilidad en el campo de la neurociencia, ya que comparten una amplia similitud con los mamíferos a nivel genético, neurales y endocrinas niveles 8. Durante la última década, las técnicas neuroanatómicas y inmunohistoquímicos estándar se han utilizado para determinar la organización característica detallada del sistema nervioso pez cebra 9-12 y de la distribución de los diferentes neurotransmisores 3,8,13. Más recientemente, los investigadores han cambiado su enfoque a los estudios funcionales 14,15, muchos de los cuales se centran en los procesos conductuales 16-19 y características electrofisiológicas de los sistemas sensoriales 2,13,20. Un pequeño número de estos estudios se han concentrado en la actividad eléctrica de las áreas específicas del adult cerebro del pez cebra 21-23, pero no se llevaron a cabo utilizando un enfoque in vivo. Este protocolo puede ser adaptado para estudios electrofisiológicos de tanto la actividad espontánea y evocada dentro del sistema nervioso pez cebra para describir los patrones de actividad en regiones específicas del cerebro. El uso de esta técnica permite que se hagan comparaciones entre la actividad neurológica de los estadios larvales y adultos jóvenes. Además, nuestro protocolo permite comparaciones entre alteraciones genéticas o farmacológicas. Junto con otros enfoques, como la ingeniería genética o pruebas farmacológicas, este método ofrece una nueva posibilidad para el análisis funcional de la comunicación neuronal y la plasticidad en el adulto animal intacto, así como para las aplicaciones potenciales, tales como el estudio de la epilepsia de inicio tardío o los procesos neurodegenerativos.

<table><tbody><tr><td>Etanol al 70%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2750HC</td><td>Diluir del 100% al 70% con agua desionizada</td></tr><tr><td>2 M Cloruro de potasio</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M Cloruro de sodio</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína tamponada al 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>pH 7,2-7,4; almacenado a -20 oC</td></tr><tr><td>Bromuro de</td> <td>pancuronioSigma-Aldrich</td><td>P1918</td><td>Diluido a 1 &mu; g/&mu; l en 1x solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>pH del agua</td><td></td><td></td><td>Habitat 7.0-7.4, conductividad de 400-450 &mu; S; mantenido por Instant Ocean y Bicarbonato de Sodio</td></tr><tr><td>Pentylenetetrazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td>Diluido a 300 mM en 1x solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>Jeringa Nanofil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>06A</td><td></td></tr><tr><td>34 G Aguja biselada</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF34BV</td><td></td></tr><tr><td>Esponja</td><td></td><td></td> Papel <td></td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>lija fina con respaldo de espuma</td> de poro pequeño 5 <td>x 5 cm2 es lo suficientemente grande Cables</td></tr> de <tr><td>batería</td><td></td><td></td><td></td>de 9 V</tr><tr><td>con pinzas</td><td></td><td></td> de cocodrilo <td>Necesita 2</td></tr><tr><td>37 cm x 42 cm Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>TW31KEM</td><td></td></tr><tr><td>11 cm x Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>de</td> 21 cm TW31KWP <td></td></tr><tr>tubo <td></td><td></td><td></td>de<td>1/8 de pulgada de diámetro</td></tr><tr><td>tubo</td><td></td><td></td><td></td>de 1 cm de diámetro</tr> tubo de <tr><td>1 mm de diámetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Válvula reductora con tapón Luer hembra y férula de silicona</td><td>Microscopio Qosina</td><td>51505</td><td></td></tr><tr><td>(Leica MZ APO)</td><td></td><td></td><td>Otro microscopio puede ser </td></tr><tr><td>tijeras Vanna</td> usadas <td>Roboz Surgical Instruments Co., Inc.</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de jeringa Luer lock de 60 ml</td><td>Becton, Dickinson and Company 309653</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Llaves de paso de 3 vías con conexiones</td><td></td><td></td><td></td>Luer</tr><tr><td>Llave de paso de 1 vía con conexión</td><td></td><td></td><td></td>Luer</tr><tr><td>Fisherbrand 100 mm x 15 mm Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific NC9299146</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 60 mm x 15 mm Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67961</td><td></td></tr><tr><td>4 en tubo capilar de borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Puede contener un filamento para ayudar a llenar con solución</td></tr><tr><td>P-97 Tirador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon Aloclamp 900A</td><td>Molecular Devices Axoclamp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-9Ax 1U</td><td>headstage Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.010 in Silver wire</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaelectrodos de la serie Q</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-A10P</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jeringa</td><td></td><td></td><td></td>de bloqueo Luer</tr> de <tr><td>1 mm x 15 pulgadas Tubo Conecte</td><td></td><td></td><td>la jeringa de bloqueo Luer al soporte de electrodos de la serie Q</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>Need 2</td></tr><tr><td>PC basado en Microsoft</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday </td> Microscopio de disección de mesa de aire para jaulas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos intacto

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Anteriormente, los estudios electrofisiológicos en adultos de pez cebra se han limitado a cortar los preparados o de preparación para la Copa del ojo y grabaciones electrorentinogram. Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos, lo que permite la grabación de la actividad neuronal. Inmovilización del adulto requiere un mecanismo para entregar el oxígeno disuelto de las branquias en lugar del movimiento bucal y opercular. Con nuestra técnica, los animales se inmovilizan y perfundidos con agua hábitat para cumplir con este requisito. Una craneotomía se realiza bajo tricaína metanosulfonato (MS-222; tricaína) anestesia para facilitar el acceso al cerebro. El electrodo primario se coloca entonces dentro de la ventana de craneotomía para registrar la actividad cerebral extracelular. A través del uso de un sistema de perfusión de haces tubulares, una variedad de compuestos farmacológicos se puede administrar a los peces adultos y cualquier alteración en la actividad neuralse puede observar. La metodología no sólo permite observaciones que se hagan con respecto a cambios en la actividad neurológica, sino que también permite que se hagan comparaciones entre las larvas y adultos de pez cebra. Esto da a los investigadores la capacidad de identificar las alteraciones en la actividad neurológica debido a la introducción de diversos compuestos en diferentes etapas de la vida.

Este protocolo se ha usado para medir la actividad neuronal de adultos de pez cebra en vivo. Estos registros electrofisiológicos se consistente y reproducible obtenidos. Figura 5 muestra un ejemplo representativo de las alteraciones inducidas nativas y de la actividad neural de un pez cebra adultos cuando pentilentetrazol (PTZ), una chemoconvulsant común 6,7,25,26, se introduce en la intubación configuración. La actividad neurológica nativo del pez cebra ...

Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener grabaciones in vivo de la actividad neuronal en el cerebro de peces cebra adultos intactos. Esto se logra primero inmovilizando un pez cebra adulto mediante la aplicación en baño de triclorometanosulfonato de metil. El segundo paso consiste en intubar al pez cebra inmovilizado.A continuación, se realiza una craneotomía bajo anestesia trica para obtener acceso al cerebro. El paso final consiste en colocar un electrodo principal dentro de la ventana de la craneotomía, lo que permite registrar la actividad cerebral extracelular. En última instancia, in vivo.La electrofisiología en el pez cebra adulto puede utilizarse para demostrar cómo diferentes compuestos farmacológicos o mutaciones genéticas pueden provocar alteraciones en la actividad neurológica nativa del pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave tanto en biología del desarrollo como en neurobiología sobre cómo los cambios en la estructura cerebral pueden afectar la actividad neuronal, tanto en el desarrollo normal como en el caso de mutaciones genéticas. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque se debe tener especial cuidado al eliminar solo una pequeña porción de la placa ósea que cubre la cabeza sin dañar el tejido cerebral.La cánula de intubación facilita la introducción de líquido en el pez. Este montaje proporciona tanto flexibilidad como firmeza para posicionar óptimamente la cánula dentro de la boca del animal. Para este montaje, retire un segmento de 1,5 centímetros del extremo ancho de una punta de pipeta P 200 utilizando un par de tijeras o una cuchilla de afeitar.A continuación, inserte un trozo de tubo de seis centímetros por un milímetro en una válvula reductora. Luego, inserte la punta de pipeta modificada en un tramo corto de tubo de un octavo de pulgada de diámetro. A continuación, se puede insertar la cánula en la punta de pipeta utilizando el tubo para mantener la punta de pipeta en posición con el cierre de seguridad.Antes del experimento, se purgó un montaje de perfusión con agua del hábitat, asegurándose de que se eliminaron todas las burbujas de aire. A continuación, añada 30 mililitros de una solución de trica 630 micromolar al montaje de perfusión craneal y permita que dos mililitros pasen a través del tubo para asegurar la administración de trica al animal al iniciarse la perfusión. Para el montaje principal de perfusión, añada 50 mililitros de agua del hábitat al primer tubo.Luego, agregue cualquier compuesto experimental deseado a cada uno de los tubos restantes. A continuación, coloque un conjunto de cánula en el orificio pequeño de la base de intubación, enrolle una tira de Kimwipe de una pulgada de ancho en una espiral apretada e insértela en el tubo de drenaje de forma que el Kimwipe sobresalga por ambos extremos. Este tejido servirá como mecha para eliminar el líquido perfundido y prevenir la acumulación de fluido dentro de la base de intubación, lo cual podría interferir con el registro electrofisiológico.A continuación, inserte un extremo del tubo en el orificio grande de la placa de Petri, permitiendo que el extremo inferior se extienda hacia un recipiente inerte lo suficientemente grande como para recoger todos los desechos de perfusión. Este recipiente servirá como depósito de salida para el montaje. Luego, coloque el tejido de manera que un extremo quede cerca de la región abdominal del animal, y la extensión inferior pueda gotear dentro del recipiente.Coloque esta base de intubación terminada cerca del microscopio de disección. Posteriormente, conecte el bloqueo lu de la cánula al tubo de perfusión trican. En este procedimiento, agregue solución de trica de 630 micromolar a una placa de Petri de 15 por 60 milímetros hasta tres cuartas partes.A continuación, pese el recipiente con campos. Esto se utilizará para inmovilizar al animal de modo que se pueda inyectar más anestesia en el peritoneo. Ahora sumerja al animal en el recipiente que contiene trica y pese nuevamente el recipiente.Luego, calcule el peso del pez restando el peso del recipiente lleno del peso total. Deje al animal en la solución de trica hasta que esté tranquilo y la mayor parte del movimiento haya cesado. Mientras el pez está sumergido en la solución de trica, use una jeringa NFI que contenga una aguja de calibre 34 para extraer la cantidad suficiente de bromuro de pantonio de modo que haya un microgramo por gramo de peso del pez.Una vez que el pez esté calmado, utilice un par de fórceps anchos para transferir el pez por la cola hacia una esponja previamente humedecida y colóquelo en posición lateral. A continuación, coloque la esponja con el pez bajo el microscopio estereoscópico. Sujete el lado dorsal del pez con un palito de helado.Luego administre bromuro de pan curio por vía intraperitoneal. Ahora use pinzas finas. Sujete al pez por la mandíbula inferior y transfiera rápidamente el animal a la base de intubación.Coloque al animal con el lado dorsal hacia arriba sobre la forma de cera de manera que la cánula de un milímetro pueda insertarse en la boca. A continuación, use la pinza fina para manipular el pez y abrir la boca alrededor de la cánula. En nuestro montaje.Se diseñó un tope en la base, lo que permite insertar la cánula tres milímetros dentro de la boca del pez. Una vez que esté en posición, encienda el tubo de perfusión por gravedad que contiene la trica. Luego, corte un trozo de tejido Kimwipe de tres centímetros cuadrados y empápelo con agua del hábitat.Coloque el tejido sobre el animal para evitar la desecación. Bajo el microscopio de disección, se prepara el pez y se espera para realizar la craneotomía. Esta zona tiene aspecto de una placa ósea oscura situada detrás del ojo.A continuación, inserte una hoja de las tijeras de rongeur en el borde de la placa y empuje con suficiente fuerza para penetrar el hueso sin perforar el cerebro. Luego, cierre las tijeras para cortar el hueso. Después de eso, retire el fragmento de hueso para la grabación de electrofisiología.Apague la intubación. Cierre la llave de paso y desconecte rápidamente el bloqueo de seguridad que une la base de la intubación al gotero tricá. Mueva el conjunto de intubación intacto hacia el microscopio de electrofisiología y conéctelo al sistema de perfusión.Encienda el hábitat, el agua y perfunda a una velocidad de un mililitro por minuto durante aproximadamente una hora. Con el fin de lavar el trica utilizando un micromanipulador, coloque el electrodo secundario de manera que la punta del electrodo pueda insertarse en la fosa nasal del animal o en la depresión bajo la mandíbula superior. Posteriormente, inserte la aguja del electrodo primario en la abertura de la craneotomía.Luego, inserte la aguja en el tejido de forma que la punta quede posicionada bastante superficial dentro del tumor óptico. Las posiciones más profundas del electrodo pueden dar como resultado una señal eléctrica pequeña para la recolección de datos en modo sin intervalos, con una frecuencia de muestreo de 5.000 hercios, junto con un filtro paso bajo de 0,1 kilohercios y un filtro paso alto de un hercio. Comience la grabación de la actividad electrofisiológica cuando el agua del hábitat haya perfundido durante un mínimo de 45 minutos.Registre una línea base de actividad nativa durante al menos 15 minutos antes de añadir los fármacos experimentales. En este experimento se monitoreó la actividad neurológica nativa del pez cebra adulto; esta figura muestra la actividad espontánea de línea base del tálamo óptico con una amplitud pequeña de alrededor de dos a 10 milivoltios durante toda la duración del registro. Tras la introducción de PTZ 15 milimolar al sistema, comenzaron a desarrollarse en cinco minutos descargas espontáneas de tipo epiléptico.La exposición continua al PTZ produjo un patrón consistente de descargas de gran amplitud de hasta 15 milivoltios, seguidas por ráfagas más pequeñas y frecuentes de actividad. Durante la realización de este procedimiento, es importante recordar tener paciencia y tomarse el tiempo necesario al manipular el animal y realizar la craneotomía. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo obtener grabaciones in vivo de la actividad neuronal en el cerebro de un pez cebra adulto intacto.Esto se logra utilizando un sistema de perfusión y realizando una craneotomía en el animal inmovilizado.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra cómo realizar mediciones de electrocardiografía (ECG o EKG), una prueba que mide la actividad eléctrica del corazón, en un pez cebra.

Electrocardiografía (ECG) de pez cebra: un ensayo mínimamente invasivo para evaluar la función cardíaca

El protocolo describe el procedimiento para realizar electrofisiología en pez cebra adulto. Este método se puede utilizar para medir la actividad neuronal in vivo.

Electrofisiología del pez cebra adulto: un método para medir la actividad eléctrica extracelular de las neuronas in vivo

Este video muestra el registro de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra paralizada colocando una micropipeta cerca del ganglio de la línea lateral y formando un sello suelto para la captura de señales. La solución extracelular mantiene la viabilidad neuronal durante este proceso.

Monitoreo de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra inmovilizada

Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una...

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

En este video, vamos a demostrar cómo registrar la actividad eléctrica de las neuronas individuales identificadas en una preparación de todo el cerebro, que preserva los circuitos neuronales complejas. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con una proteína fluorescente para la identificación en la preparación cerebro intacto.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Aquí, presentamos un método confiable, mínimamente invasivo y rentable para registrar e interpretar electrocardiogramas en peces de cebra adultos anestesiados vivos.

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Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

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El presente protocolo describe el aislamiento agudo de células viables del músculo liso cardíaco y vascular de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios (Danio rerio), adecuados para estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de células musculares lisas cardíacas y vasculares de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios para estudios electrofisiológicos

Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal de pez cebra adulto.

Imágenes de calcio de dos fotones de la actividad del prosencéfalo en peces cebra adultos que se comportan

El estudio presenta Zebra II, un sistema avanzado para la adquisición y análisis prolongados de ECG en pez cebra. Este sistema cuenta con un sistema de perfusión independiente y electrodos de múltiples puntos para el manejo de múltiples peces en entornos controlados. Se evaluaron y analizaron los efectos agudos de la amiodarona con pez cebra de tipo salvaje.

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Aprende a realizar registros electrofisiológicos in vivo en el cerebro de peces cebra adultos intactos mediante inmovilización, intubación y craniotomía. Este método permite estudiar la actividad neural en tiempo real.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

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