Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Los objetivos de este protocolo son utilizar la perfusión LOR para aislar miocitos cardíacos de corazones de ratones adultos con genética conocida y analizar la contractilidad y los transitorios de calcio de los miocitos. Después de una inyección de heparina, se extrae el corazón de un ratón anestesiado. Se monta rápidamente a través de la aorta a una cánula conectada a una jeringa de tampón de perfusión.

La aorta está asegurada. Se perfunde lentamente una sutura y un tampón para despejar las arterias coronarias. A continuación, la cánula se monta en un aparato LOR con tampón de perfusión fluido.

El corazón se digiere con una solución libre de calcio de colagenasa y proteasa hasta que está palpablemente blando. El ventrículo izquierdo se coloca en el tampón libre de calcio y se dispersa con pinzas y pipeteo suave. Después de que la solución se filtra a través de la malla, las células se introducen gradualmente a concentraciones más altas de calcio para eliminar las células muertas y garantizar que los miocitos sean tolerantes al calcio.

Las células sanas tienen forma de bastón, mientras que las células muertas carecen de esta forma. A continuación, los miocitos se cargan con un tinte radiométrico de unión al calcio RA dos A y se colocan en la platina del microscopio. Para el análisis, las células se estimulan eléctricamente, mientras que la contractilidad se mide mediante la detección de longitud y bordes del sarcómero y los transitorios de calcio se miden analizando el desplazamiento espectral de las dos células cargadas de RA.

La miocardiopatía dilatada es causada por una variedad de mutaciones. Sin embargo, comprender el mecanismo detrás de esta enfermedad cardíaca puede ser difícil. El aislamiento de cardiomiocitos nos permite analizar la contractilidad y los transitorios de calcio de la célula contráctil del corazón, libre de calcio y 1,2 milimolares.

Las soluciones de calcio se pueden preparar con anticipación el día del aislamiento. Prepare el tampón de profusión libre de calcio para la digestión, el tampón enzimático y los tampones de transferencia A y B según el protocolo escrito. Filtrar todas las soluciones a través de un filtro de 0,2 micras antes de su uso.

Haga que los tampones de transferencia del uno al cuatro con concentraciones crecientes de calcio mezclen los tampones A y B de acuerdo con el protocolo escrito. Ajuste el caudal de un aparato LOR a tres mililitros por minuto y ajuste la temperatura del baño de agua circulante de modo que el flujo de salida de la punta de la cánula sea de unos 37 grados. Haga pasar etanol al 70% por el sistema durante 15 minutos, seguido de cien mililitros de agua, asegurándose de que se eliminen todas las burbujas del sistema.

Antes de su primer aislamiento, cree una cánula conectando un trozo corto de tubo de PE 50 a la punta de un adaptador de talón de señuelo de 20 3G y caliente la punta del tubo para crear un pequeño labio. Conecte la cánula a una jeringa pequeña con cierre lu llena de tampón de perfusión. Asegúrese de que la cánula esté llena de tampón.

Inyecte a un ratón 200 heparina mediante inyección IP. Comience a pasar el tampón de profusión a través del L endorf para que se ejecute completamente a través del sistema antes de que se conecte el corazón. Después de cinco minutos, anestesiar al ratón con flúor.

Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado para pellizcar firmemente el dedo del pie bilateral. Abra el tórax cortando por debajo del esternón y a ambos lados de la caja torácica, extirpe rápidamente el corazón, teniendo cuidado de dejar la mayor cantidad posible de aorta unida al corazón. Coloque inmediatamente el corazón en hielo.

Tampón de profusión fría, que actúa lo más rápido posible Bajo un microscopio de disección, extraiga cualquier tejido adicional. Trabaje con cuidado para eliminar el exceso de grasa sin dañar la aorta subyacente. Recorta la aorta justo debajo de las primeras ramas.

Con dos pares de pinzas finas, agarre con cuidado el borde de la aorta y tire suavemente sobre la punta de la cánula. Asegúrese de que la punta de la cánula no pase a través de la válvula aórtica hacia el ventrículo izquierdo. Asegure la aorta con un pequeño asa de sutura 5.0.

Empuje suavemente una pequeña cantidad de tampón de perfusión a través de la cánula, observando si las arterias coronarias se limpian de sangre. Retire la cánula de la jeringa y conéctela al aparato L endorf con perfusión fluida. Búfer. Tenga cuidado de no introducir burbujas.

Permita que el tampón de perfusión fluya a través del corazón durante dos o tres minutos. Perfuse eight debe pasar de sanguinolento a claro, cambiar el flujo a la digestión, tamponar y digerir durante siete a 10 minutos. Una vez que el tampón se ha llenado, el flujo de lang endorf se puede reciclar una vez que el corazón está palpable.

Flacido, retirar de la cánula y colocar en una placa P 60 con tampón a. Extraer las aurículas, los grandes vasos y el ventrículo derecho y transferir a una segunda placa de tampón a. Usar fórceps.

Separe suavemente el ventrículo izquierdo en pedazos pequeños. Si el corazón se digiere adecuadamente, el tejido debe separarse fácilmente pipeteando suavemente varias veces con una pipeta de transferencia estéril de cinco milésimas de pulgada para dispersar aún más las células. Utilice una pipeta pasada estéril para transferir la solución que contiene células y tejido a través de un filtro de malla de nailon de 250 micras a un tubo cónico de 50 mililitros.

Deje que las celdas se granulen durante aproximadamente 10 minutos. Las células vivas se depositarán en el fondo de la bolita y las células muertas flotarán. Transfiera el pellet al tampón de transferencia de calcio de 0,06 milimolares.

Deje reposar durante 10 minutos, aspire el sobrenadante que contiene las células muertas y transfiera el pellet a la solución de calcio de 0,24 milimolares. Repita la granulación, la aspiración y la transferencia a través de soluciones de calcio crecientes hasta que las células se hayan granulado en el tampón de transferencia de calcio de 1,2 milimolares. En este punto, el gránulo contendrá muchas células sanas en forma de bastón, que no se contraerán espontáneamente para cargar las células con menos o dos tintes.

Transfiera una milésima de pulgada de células resuspendidas a un tubo de orph de una milésima de pulgada. Añadir un microlitro de un milimolar fira dos en DMSO anhidro. Mezcle invirtiendo suavemente el tubo.

Deje que las células se granulen durante 15 a 20 minutos en la oscuridad después de que las células se hayan lavado aspirando el sobrenadante y agregando 1,2 milimolares de solución de calcio tyro. Mezcle y deje que las células se asienten durante cinco a 10 minutos más. A continuación, repita el lavado.

Configure el microscopio invertido para la recopilación de datos. En primer lugar, coloque una cubierta de vidrio en un inserto de etapa diseñado para la aspiración de profusión y para la estimulación eléctrica de las células. Si utiliza un objetivo de aceite, coloque una gota de aceite en la lente de 40 x y coloque el inserto de la platina en el microscopio.

Coloque los electrodos. Configure una profusión calentada impulsada por la gravedad de 1,2 milimolares de solución de calcio tyro y conecte la aspiración al vacío. Encienda el microscopio y el sistema de marcapasos celulares.

Abra el software del asistente de iones. Cargue unas gotas de unas pocas o dos células cargadas en la platina mientras bloquea el flujo de perfusión. Para permitir que las células sanas se asienten, restauren la profusión, muchas de las células muertas restantes serán lavadas.

Utilice el ocular para localizar una célula sana en forma de bastón que se contrae al caminar a cinco a 20 voltios espontáneamente, se deben evitar las células que se contraen debido a la fuga de la membrana. Cambie la salida visual a la cámara. Ajuste la rotación de la lente para que la celda sea visible en la ventana.

Ajuste la apertura para que se elimine la mayor parte del fondo. Coloque el marcador de medición del sarcómero sobre un área de la celda con sarcómeros uniformes. Cambie el tamaño de la caja si es necesario para asegurarse de que el marcador no cubra diferentes poblaciones de, si lo desea.

Alinee también las barras de detección de bordes. Comience a marcar el ritmo de las celdas de 10 a 15 segundos antes de comenzar el experimento. Empieza a grabar.

Analice el acortamiento del sarcómero y las trazas de dos relaciones de URA con el software del asistente de iones. Las posibles comparaciones entre los cardiomiocitos de tipo salvaje y los cardiomiocitos knockout incluyen el acortamiento fraccional del tiempo hasta el pico, el acortamiento del tiempo hasta el 50% para el análisis de contractilidad, así como el tiempo de pico hasta el pico y el tiempo hasta el 50%, el miedo basal o dos proporciones para evaluar el flujo de calcio. Las células producidas con este protocolo son ideales para muchos otros experimentos y procedimientos, incluida la tinción de componentes subcelulares y el cultivo a corto plazo.

Ahora que has visto este vídeo, deberías ser capaz de aislar cardiomiocitos de ratones de tipo salvaje y knockout y analizar la contractilidad y los transitorios de calcio de estas células. Buena suerte con tu experimento.