Name: Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a evaluar la regeneración vascular en el SNC utilizando un modelo de retinopatía inducida por oxígeno en ratones. Este protocolo permite estudiar mecanismos de crecimiento de vasos sanguíneos tras lesión isquémica.

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PS tiene una Cátedra de investigación de Canadá en Biología Celular de la retina y el Premio del Instituto de Investigación Alcon Nueva investigador. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (221,478), la Asociación Canadiense de Diabetes (OG-3-11-3329-PS), las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (418.637) y la Fundación Lucha contra la Ceguera Canadá. El apoyo también fue proporcionado por el Réseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.

Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales se adhiere a los lineamientos de cuidado animal establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Visión Investigación y el Consejo Canadiense de los Animales. 1. Oxígeno inducido Retinopatía (OIR) <ol><li> Fecha de apunte de nacimiento de crías de ratón como P0. </li><li> Registre todos los pesos de los animales a la entrada en O 2 para asegurar una variedad de peso adecuado. Nota: Para C57BL / 6 ratones a P17, peso corporal debe oscilar entre 5 y 7,5 g para NV máxima 32. Con el fin de mantener la coherencia del medio ambiente, se recomienda utilizar como compañeros de camada de control (para los ratones modificados genéticamente, así como los ratones que recibieron tratamientos experimentales). Al evaluar los efectos de un vector viral, se debe considerar el tropismo del virus y dar tiempo suficiente para la plena expresión de transgenes viralmente entregados. Viral rápidamente expresandovectores tales como los lentivirus 3 ª generación 24, 25, se recomiendan 33. </li><li> Cachorros Place ratón en P7 (C57BL / 6 o deseado cepa) y una CD1 fomentar madre en una cámara de oxígeno fijado en el 75% de O 2 durante 5 días 27. La humedad del ambiente y la temperatura se mantienen constantes a lo largo de O 2 de la exposición. Nota: Las instalaciones de investigación equipados con una fuente central de O 2 son ideales y limitan la sustitución engorroso de O 2 tanques vacíos. Si se trabaja con ratones manipulados genéticamente, es importante asegurarse de que los ratones control y experimental se adquieren del mismo proveedor para limitar las derivas genéticas dentro de las mismas cepas 30, 29. </li><li> En P12, eliminar a los ratones de la cámara de oxígeno y devolver los animales al ambiente de O 2. </li></ol> 2. Inyección intravítrea de Entrega de los compuestos de la retina interna (Whes evaluar los efectos de un compuesto farmacológico o Proteína Recombinante) <ol><li> En P14, anestesiar a los ratones con 2% de isoflurano en oxígeno 2 L / min (o comité de protección de los animales aprobado anestésico de elección). Con el fin de verificar la eficacia de la anestesia, secuencialmente pellizcar la cola, pata trasera y el oído con pinzas. </li><li> Coloca el ratón sobre su vientre. </li><li> Usando una jeringa estéril de 10 l equipado con una aguja de vidrio tirado biselado, realizar una inyección de un volumen máximo de 1 l de solución que contiene el compuesto que está siendo investigado o vehículo (solución salina fisiológica) en el limbo posterior del ojo, con un 45 ° ángulo de evitar la lente. Nota: El-aguja de vidrio arrastrado está unido a la jeringa utilizando una gota de resina epoxi. </li><li> Aplique una gota de ungüento oftálmico lubricante (idealmente con antibióticos) con un hisopo para el ojo del ratón. </li><li> Devuelva el ratón de nuevo a la jaula con el fomento de la madre. Los ratones son entonces monitoreados cuidadosamente hasta que recubierto y totalmente ambulatoria. </li></ol> 3. Evaluación de la perfusión de buques y la función de barrera (Integridad) mediante angiografía con fluoresceína <ol><li> Anestesie ratones con 2% de isoflurano en oxígeno 2 L / min (o comité de protección de los animales aprobado anestésico de elección). Con el fin de verificar la eficacia de la anestesia, secuencialmente pellizcar la cola, pata trasera y el oído con pinzas. Nota: Esto se realiza típicamente a P17 cuando se evalúa la regeneración. También llevar-a cabo el análisis en P19 y P21 para determinar si la integridad vascular se conserva en el tiempo. </li><li> Una vez anestesiado, se pesa el ratón. </li><li> Haga una incisión en la línea media del abdomen con unas tijeras de disección. Nota: Los instrumentos de disección se deben revisar y afilados con regularidad. </li><li> Cortar las costillas lateralmente y elevar la caja torácica con la ayuda de fórceps. Nota: Es necesario cortar como lateralmente como sea posible para evitar daños en el corazón. </li><li> Después de retirar periptejido heral desde el corazón, pinza la aorta descendente con unas pinzas hemostáticas. </li><li> Inyecte lentamente con fluoresceína dextrano al ventrículo izquierdo con una aguja 25. Nota: Si la función de barrera vascular se investiga, se emplea 70 kDa fluoresceína-dextrano, ya que se saldrá de los vasos cuando se ve comprometida la integridad del vaso. Si el investigador quiere lanzar vasos sanguíneos, se utiliza 2 MDa fluoresceína-dextrano. Los pasos críticos: 1) Para asegurar un reparto homogéneo, centrifugar fluoresceína dextrano e inyectar el sobrenadante, 2) Con el fin de prevenir la constricción de vasos, inyectar solución de fluoresceína dextrano calentado, 3) su tiempo de circulación no debe exceso de 4 min. </li><li> Decapitar a los ratones 2 min después de la inyección con unas tijeras de funcionamiento. </li></ol> 4. Enucleación y fijación de los ojos Nota: Al evaluar las posibilidades de regeneración vascular, primero recoger retinas en P12 y P14 y, además, al P17. Aumentar el número de punto en el tiempo de muestreos para una determinación más precisa de las tasas de revascularización 24. <ol><li> Incline la cabeza del ratón y colocarlo en su lado. </li><li> Quite la piel y los párpados cubren los ojos con unas tijeras de disección. </li><li> Coloque fórceps curvados debajo del ojo y suavemente tire hacia arriba hasta que el nervio óptico se corta. </li><li> Gire la cabeza del ratón hacia el otro lado y realizar los mismos pasos (pasos 4.2 y 4.3). </li><li> Para asegurar una mejor penetración de fijador, perforar un agujero en la cámara anterior del ojo utilizando aguja de 30 g. </li><li> Transferencia de ojos a un tubo que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) y fijar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar PFA y lavar los ojos 4 veces con una solución de PBS enfriado en hielo. </li></ol> 5. Disección de retina <ol><li> Coloque los ojos de ratón en una placa de Petri que contiene PBS frío y realizar la disección de las retinas bajo un microscopio estereoscópico. </li><li> Quite la grasa / tejido adicional que rodea el ojo con ciencia microdisecciónssors. </li><li> Cortar la córnea con tijeras micro-disección. </li><li> El uso de dos pares de pinzas, minuciosamente la cáscara de la esclerótica de distancia desde la periferia hacia el nervio óptico y desechar. </li><li> Apriete la lente (bola blanquecina debajo de la córnea) con unas pinzas y extraerlo de la caja del visor. Use un par de pinzas como soporte, y la otra para agarrar y levantar con cuidado y retire el objetivo. </li><li> Separar los vasos hialoideos desde el lado interior de la retina utilizando cepillos pequeños (tamaño 0) y fórceps. </li><li> Retire los bloques de vasos hyaloid conectados al disco óptico utilizando fórceps. </li><li> Transferencia diseccionó la retina a 2 ml de tubos de microcentrífuga que contiene PBS y lugar en hielo antes de comenzar el procedimiento de tinción. </li></ol> 6. Retiniana vascular tinción <ol><li> Incubar las retinas disecadas durante la noche con agitación suave a 4 ° C en una solución de fluorescencia B4-isolectina acoplado (rodamina-lectina u otra) en PBS que contenía 1 mM de CaCl2 </sub&gt; (se recomienda una dilución de una solución B4 2 mg / ml isolectina 1:100). Durante todo el procedimiento de tinción, cubrir los tubos con papel de aluminio o una lámina opaca para protegerlo de la luz. </li><li> Al día siguiente, eliminar la solución de tinción y lavar las retinas 3x en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. </li></ol> 7. Preparación de la retina Flatmounts <ol><li> Traslado retinas, del lado de los fotorreceptores hacia abajo, en un portaobjetos de microscopio y hacer cuatro profundas incisiones radiales equidistantes utilizando un bisturí quirúrgico para dividir la retina en cuatro cuadrantes de igual tamaño. Durante las incisiones, prepararse la retina con un cepillo de modo que no se mueve. </li><li> El uso de dos cepillos empapados en PBS, aplane cuidadosamente la cuadrantes fotorreceptor boca abajo y sumergir la retina en medio de montaje para evitar la foto-blanqueo. A continuación, coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la superficie de la retina montado sin la aplicación de presión y asegurarse de que las burbujas de aire no se acumulan debajo de la hoja de la cubierta. &lt;/ Li&gt; </ol> 8. Imaging y Cuantificación de Vasoobliteration (VO) y neovascularización (NV), como se ha descrito previamente 31 <ol><li> Tomar imágenes de retinas-todo ello montado con un microscopio de epi-fluorescencia con un aumento de 10X. </li><li> Abre la imagen en la retina en software de edición fotográfica, hilvanar y medir el área total de la retina, y la zona avascular. Área puede expresarse en píxeles. </li><li> Determinar la extensión del VO dividiendo el número de píxeles en la zona avascular por el número de píxeles en el área total de la retina. </li><li> Determinar la extensión de NV dividiendo el número de píxeles de NV por el número de píxeles en el área total de la retina tal como se describe 31. </li></ol>

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<li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy%3A+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).</li>
<li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).</li>
<li>Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+selection+for+different+mtDNA+genotypes+in+heteroplasmic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice.</a> Nat Genet. 16, 93-95 (1997).</li>
<li>Mattapallil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rd8+mutation+of+the+Crb1+gene+is+present+in+vendor+lines+of+C57BL%2F6N+mice+and+embryonic+stem+cells%2C+and+confounds+ocular+induced+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmolog.%2C+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes.</a> Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

¿Cuál es la forma más eficaz para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanos en el tejido nervioso isquémico? ¿Es terapéuticamente válida para interferir con y acelerar origen natural recrecimiento vascular? En patologías neuro-isquémica como retinopatías isquémicas o derrame cerebral, degeneración vascular se asocia con una reducción de la función neuronal 35-38. Por lo tanto para hacer frente a la lesión inicial, el restablecimiento de la microcirculación regional durante la fase inmediata / temprana de...

A lo largo del desarrollo del SNC, los nervios, las células inmunes y los vasos sanguíneos establecer redes notablemente acoplados a garantizar una adecuada perfusión tisular y permitir la transmisión de información sensorial 1-5. El detalle de los resultados de los sistemas vasculares en la oxigenación tisular insuficiente y suministro metabólico comprometido y está cada vez más reconocido como un importante contribuyente a la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas 6. Deserción vascular y el deterioro de la unidad neurovascular dentro del cerebro, por ejemplo, se asocia con demencia vascular, lesiones vasculares de la materia blanca del cerebro 7 y la enfermedad de Alzheimer con estenosis de las arteriolas y los vasos pequeños 8. Además, se cree alteración de la función barrera vascular para contribuir esclerosis múltiple 9 y la esclerosis lateral amiotrófica 10. De importancia directa para el modelo de la retina se describe en este protocolo, el cegamientoenfermedades tales como la retinopatía diabética 11 y la retinopatía de la prematuridad 12, 13 se caracterizan por una fase de degeneración vascular temprano. El estrés isquémico posterior sobre la retina neurovascular desencadena una segunda fase de la neovascularización excesiva y patológica que probablemente se origina como una respuesta compensatoria a oxígeno restablecerá y suministro de energía 14-16. Una estrategia atractiva para superar el estrés isquémico que es central a la progresión de la enfermedad es restaurar redes vasculares funcionales específicamente en las zonas isquémicas de la neuro-retina (Figuras 2 y 3). Provocar una respuesta angiogénica controlada puede venir a través como contra-intuitivo para una condición en la que los tratamientos anti-angiogénicos tales como anti-VEGF son considerados como tratamientos adaptados. Sin embargo, la evidencia de la validez de este enfoque es el montaje. Por ejemplo, la mejora de recrecimiento vascular &quot;fisiológica-like&quot; en ischemretinopatías ic se ha demostrado elegantemente a través de la introducción de las células precursoras endoteliales 17, la inhibición de VEGF de células de Müller-expresado regulación a la baja inducida de otros factores angiogénicos, 18 de inyección de progenitores mieloides 19, la inhibición de NADPH oxidasa inducida por la apoptosis 20, el aumento de la dieta ω-3 grasos poliinsaturados la ingesta de ácido 21, el tratamiento con un fragmento carboxilo-terminal de triptófano ARNt sintetasa 22, y la administración directa de VEGF o FGF-2 para la protección de las células gliales 23. Por otra parte, hemos demostrado que la modulación de las señales de orientación neuronales clásicas tales como Semaphorins o netrinas en retinopatías isquémicas acelera la regeneración vascular de los vasos sanos dentro de la retina y, en consecuencia reduce la angiogénesis patológica 24, 25. De relevancia clínica directa, varios de los estudios en animales antes mencionados proporcionan evidencia de que la promoción de re vasculargeneración durante la fase isquémica temprana de retinopatías puede reducir significativamente la neovascularización que ponen en peligro la vista previa de la retina 19, 23, 24, 26, probablemente a través de la reducción de la carga isquémica. La elaboración de estrategias terapéuticas que estimulan la regeneración de los vasos funcionales sigue siendo un reto importante para los biólogos vasculares. Aquí se describe un sistema experimental que emplea el modelo de ratón de la retinopatía inducida por oxígeno (OIR) para explorar estrategias para modular el recrecimiento vascular en la retina. Desarrollado por Smith et al. En 1994 27, este modelo sirve como sustituto de las retinopatías proliferativas humanas y consiste en la exposición de las crías P7 ratón al 75% de O 2 hasta el P12 y, posteriormente, la reintroducción de las crías al ambiente de la sala O2-tensión (Figura 1). Este paradigma imita débilmente un escenario en el que se ventila un bebé prematurocon O 2. La exposición de las crías de ratón a hiperoxia provoca degeneración de los capilares de la retina y de la microvasculatura, y produce una superficie reproducible de vaso-obliteración (VO) suele evaluarse a la salida de O 2 en P12, aunque el área de VO máxima se alcanza a las 48 horas (P9) después exposición a O 2 28. En el ratón, las zonas avasculares VO regeneran espontáneamente en el transcurso de la semana siguiente a la reintroducción de aire de la habitación y finalmente zonas VO están completamente re-vascularizados (Figura 2). La reintroducción de aire de la sala de ratones sometidos a OIR también provoca la neovascularización de la retina antes de la (NV) (máximo a P17) que se evalúa típicamente para determinar la eficacia de los paradigmas de tratamiento anti-angiogénicos. En su forma más pura, el modelo OIR proporciona una herramienta altamente reproducible y cuantificable para evaluar la degeneración vascular inducida por el oxígeno y determinar el grado de destrucción neovascularización pre-retinal 29-31. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Varios paradigmas de tratamiento exploratorio que modulan la regeneración vascular del SNC puede ser investigada mediante el modelo de OIR, incluyendo el uso de los compuestos farmacológicos, la terapia génica, la supresión de genes y más. La propensión de un enfoque dado para influir en el nuevo crecimiento vascular se evaluó paso a paso en la ventana entre P12 (VO máxima después de la salida de la hiperoxia) y P17 (NV máxima). Evaluación de los resultados del tratamiento en NV patológica se puede determinar rápidamente y fácilmente en paralelo y ha sido descrita a fondo por Stahl y colegas 30, 31. Aquí le ofrecemos una forma sencilla y paso a paso para investigar la modulación de revascularización fisiológica dentro de la retina neural por compuestos farmacológicos, terapéuticos potenciales, vectores virales o para estudiar la influencia de los genes candidatos en los ratones manipulados genéticamente.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57Bl/6 (Se pueden utilizar otras cepas; la respuesta angiogénica varía de una cepa a otra)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Madres lactantes CD1</td><td>Proveedor preferido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación rectas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14192</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección rectas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de ojo Vannas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8483</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de iris, curvas, dentadas</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Cepillos 362R tamaño 0</td><td>Pinzas Dynasty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3; rectas</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica, tamaño 10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 Microscopio de fase invertida y fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ9.5 Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoticanato de fluoresceína-dextrano, 70000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la vascular regeneración en el snc utilizando la retina del ratón

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

La retina de roedor es tal vez el sistema de mamífero más accesible en el que para investigar la interacción neurovascular dentro del sistema nervioso central (SNC). Se está reconociendo cada vez más que algunas enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, la esclerosis múltiple y la esclerosis lateral amiotrófica elementos presentes de compromiso vascular. Además, las causas más importantes de ceguera en la población de edad pediátrica y de trabajo (retinopatía del prematuro y la retinopatía diabética, respectivamente) se caracterizan por una degeneración vascular y la insuficiencia de recrecimiento vascular fisiológico. El objetivo de este documento técnico es proporcionar un protocolo detallado para estudiar la regeneración vascular del SNC en la retina. El método puede ser empleado para dilucidar los mecanismos moleculares que conducen a la insuficiencia de crecimiento vascular después de la lesión isquémica. Además, las posibles modalidades terapéuticas para acelerar y restaurar plexos vasculares sanas se pueden explorar. Hallazgos obtaineD utilizando el enfoque descrito puede proporcionar vías terapéuticas para retinopatías isquémicas tales como el de la diabetes o la prematuridad y posiblemente beneficiar a otros trastornos vasculares del SNC.

El modelo OIR es ampliamente utilizado para estudiar la degeneración vascular inducida por el oxígeno y la neovascularización patológica inducida por isquemia en la retina y ha sido instrumental en el desarrollo de tratamientos anti-angiogénicos que trabajan actualmente para las enfermedades oculares 27, 29, 30. Los resultados obtenidos con este modelo pueden ser libremente extrapolar a retinopatías isquémicas tales como la retinopatía diabética proliferativa y retinopatía del prematuro 30. <p ...

La retina de roedores ha sido reconocida como una ventana de acceso al cerebro. En este documento técnico se proporciona un protocolo que emplea el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno para estudiar los mecanismos que conducen al fracaso de la regeneración vascular en el sistema nervioso central después de la lesión isquémica. El sistema descrito también se puede aprovechar para explorar estrategias para promover el nuevo crecimiento de vasos sanguíneos funcionales dentro de la retina y sistema nervioso central.

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

El objetivo general de este procedimiento es explorar estrategias para promover la regeneración de vasos sanguíneos funcionales en la retina y en el SNC tras una lesión isquémica. Esto se logra primero utilizando un modelo murino de retinopatía inducida por oxígeno. A continuación, los compuestos se administran al ojo mediante inyecciones intravítreas.La perfusión del vaso y la función de barrera se verifican luego mediante angiografía con fluoresceína. El paso final consiste en extraer el ojo y aislar la retina. A continuación, la retina se tiñe, se monta y se somete a imagenología.En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para evaluar las tasas de regeneración vascular tras tratamientos intravítreos o en ratones con modificaciones genéticas. La técnica que presentamos ofrece un sistema altamente reproducible y sencillo para evaluar la regeneración vascular dentro del sistema nervioso central. Se basa en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno de Smith y puede ser muy útil para diseñar estrategias terapéuticas destinadas a corregir la isquemia en el sistema nervioso central.Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos moleculares que impulsan o impiden la regeneración funcional de los vasos sanguíneos en el SNC. Puede utilizarse para estudiar el impacto de genes, compuestos farmacológicos, o para elucidar los mecanismos patológicos que inician el crecimiento vascular.Además de las enfermedades oculares, esta técnica puede extrapolarse a otras áreas del SNC, como el cerebro y la médula espinal. Se requiere práctica para inyectar con éxito compuestos en el humor vítreo de crías de ratón y para manipular con cuidado la fresca preparación. Para comenzar, coloque crías de ratón en P7 y una madre nodriza CD1 en una cámara de oxígeno ajustada al 75 % de oxígeno; cinco días después, retire los animales de la cámara y devuélvalos a las condiciones normales de alojamiento. A continuación, en P12 o P14, se realizan inyecciones intravítreas para administrar compuestos a la retina interna.Después de anestesiar a los ratones, verifique la efectividad de la anestesia pellizcando secuencialmente con pinzas la cola, el pie trasero y la oreja. Se debe preparar con antelación una aguja de vidrio estirada con bisel, conectada a una jeringa de 10 microlitros con una gota de resina epoxi. Localice el sitio de inyección en el limbo posterior del ojo.Inserte la aguja en un ángulo de 45 grados e inyecte el compuesto de interés. Después de aplicar la pomada en el ojo, devuelva el ratón a la jaula con una madre de cría para comenzar a centrifugar la solución de fluoresceína dextrano y recoger el sobrenadante con el fin de prevenir la constricción vascular. Caliente la solución de fluoresceína dextrano antes de inyectarla.A continuación, confirme la profundidad de la sedación en el ratón anestesiado. Cuando esté listo, realice una incisión media sobre el abdomen con tijeras de disección. Tras abrir la caja torácica y eliminar el tejido periférico del corazón, sujete la aorta descendente.Inserte una aguja de 25 gauge llena con dextrano de fluoresceína calentado en el ventrículo izquierdo y realice la perfusión de la solución. En cuestión de dos minutos tras la inyección, decapite al animal y coloque la cabeza de lado. Retire la piel y los párpados que cubren el ojo con tijeras de disección.A continuación, coloque la pinza curva debajo del ojo y tire suavemente hacia arriba hasta que el nervio óptico se corte. Gire la cabeza del ratón hacia el otro lado y repita estos pasos. Para asegurar una mejor penetración del fijador, haga un orificio en la cámara anterior del ojo.Usando una aguja de calibre 30, transfiera los ojos a un tubo que contenga paraformaldehído al 4% y fíjelos durante una hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, elimine el PFA y lave los ojos cuatro veces con PBS frío. Coloque los ojos en una placa de Petri que contenga PBS frío y colóquelos bajo un microscopio estereoscópico.Una vez en su lugar, retire cualquier tejido adicional que rodee el ojo con tijeras de microdisección y corte la córnea. Utilice dos pares de pinzas para desprender la esclerótica desde la periferia hacia el nervio óptico. Prensione el cristalino con las pinzas y extráigalo del vaso del ojo.Utilice un par de pinzas como soporte y el otro par para sujetar, levantar con cuidado y retirar la lente. Separe los vasos aloides del lado interno de la retina utilizando un pincel pequeño y pinzas. A continuación, retire los haces de vasos hialoides conectados al disco óptico usando pinzas.Transfiera las retinas disecadas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga PBS y colóquelo en hielo. Antes de comenzar el procedimiento de tinción, las retinas disecadas se incuban primero durante la noche con agitación suave a cuatro grados Celsius. En una solución, una isotiocitina B4 acoplada con fluorescencia que contiene cloruro de calcio. Durante todo el procedimiento de tinción, los tubos deben cubrirse con papel de aluminio para protegerlos de la luz al día siguiente.Retire la solución de tinción y lave las retinas tres veces en PBS durante 10 minutos. A temperatura ambiente, transfiera las retinas con el lado de los fotorreceptores hacia abajo sobre un microscopio. Deslice la preparación mientras sostiene la retina con un pincel.Realice cuatro incisiones radiales profundas y equidistantes. Utilizando un escalpelo quirúrgico, aplane cuidadosamente los cuadrantes e introduzca la retina en medio de montaje para fotoblanquear; coloque con cuidado una lámina de cubierta sobre la superficie de la retina montada sin aplicar presión y evitando burbujas de aire. Finalmente, se obtienen imágenes de los portaobjetos y se cuantifican.Para la oclusión vascular, se observó un aumento dependiente de la dosis en la regeneración vascular después de la inyección de Trin uno en el día P14 y el rebrote. En el día P17, se evaluaron los vasos con función de barrera comprometida que presentaban fugas de fluorescencia tras la perfusión con dextrina fluorescente tras una inyección intravítrea de lentivirus. En el día P3, la inhibición de IRE uno alfa mejoró notablemente la regeneración vascular durante la fase de crecimiento vascular en el día P17.Una vez dominadas estas técnicas, la inyección intravítrea, la perfusión cardíaca y la extracción retiniana deberían tardar aproximadamente 10 minutos cada una si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante preservar la estructura tridimensional del ojo, evitar una presión excesiva que pueda dañar la retina y comprometer los resultados. No olvide que trabajar con animales, virus o compuestos bioactivos puede ser extremadamente peligroso.Siempre se deben utilizar precauciones de seguridad y herramientas esterilizadas al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultivo de neuronas ganglionares retinianas de rata axotomizadas con glia envolvente olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas (RGN) co-cultivadas con células gliales de envoltura olfativa humanas inmortalizadas. Las RGN están inmunomarcadas, con somas rojos y axones...

Imagen y cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Este video muestra un método, utilizando una clínica 3 T escáner, por contraste mejorado la RM del ratón proyección visual ingenuo y para estudios repetitivos y longitudinales en vivo de la degeneración del nervio óptico asociadas con lesión por aplastamiento del nervio óptico aguda y degeneración del nervio óptico crónica en ratones knock-out (KO p50).

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Las herramientas utilizadas para visualizar la regeneración vascular requieren métodos para contrastar los árboles vasculares. Esta película demostró una delicada técnica de inyección utilizada para lograr un contraste óptimo de los árboles vasculares e ilustra los beneficios potenciales resultantes de un análisis detallado de la muestra resultante utilizando μCT y secciones histológicas seriadas.

La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

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Este protocolo describe un método detallado para la preparación y tinción de inmunofluorescencia de ratones montados planos de retina y análisis. El uso de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA) para crías de ratones y el procesamiento de imágenes también se describen en detalle.

Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Aquí, describimos un protocolo optimizado para la oclusión de la vena retiniana utilizando rosa de bengala y un sistema de microscopio de imágenes de retina guiado por láser con recomendaciones para maximizar su reproducibilidad en cepas modificadas genéticamente.

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Este protocolo describe un método simple y económico para cuantificar la actividad de los elementos reguladores cis (es decir, potenciador / promotores) que viven en la retina del ratón a través de electroporación explante. Preparación del análisis de ADN, la disección de la retina, la electroporación, la cultura de explantes de retina, y después de la fijación y cuantificación se describen.

La cuantificación de la actividad de Cis Elementos reguladores en la retina del ratón por electroporación explante

Aprende a evaluar la regeneración vascular en el SNC utilizando un modelo de retinopatía inducida por oxígeno en ratones. Este protocolo permite estudiar mecanismos de crecimiento de vasos sanguíneos tras lesión isquémica.

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

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