Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

La retina de roedores ha sido reconocida como una ventana de acceso al cerebro. En este documento técnico se proporciona un protocolo que emplea el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno para estudiar los mecanismos que conducen al fracaso de la regeneración vascular en el sistema nervioso central después de la lesión isquémica. El sistema descrito también se puede aprovechar para explorar estrategias para promover el nuevo crecimiento de vasos sanguíneos funcionales dentro de la retina y sistema nervioso central.

El objetivo general de este procedimiento es explorar estrategias para promover el recrecimiento de los vasos sanguíneos funcionales dentro de la retina y el SNC después de una lesión isquémica. Esto se logra utilizando primero un modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno. Los siguientes compuestos se administran al ojo mediante inyecciones intravítreas.

La perfusión vascular y la función de barrera se verifican mediante angiografía con fluoresceína. El paso final es extraer el ojo y aislar la retina. A continuación, se tiñe la retina y se monta antes de la obtención de imágenes.

En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para evaluar las tasas de regeneración vascular después de tratamientos intravítreos o en ratones con modificaciones genéticas. La técnica que presentamos proporciona un sistema altamente reproducible y fácil de evaluar para evaluar la regeneración vascular dentro del sistema nervioso central. Se basa en el modelo de Smith de la retinopatía inducida por oxígeno y puede ser muy útil en el diseño de estrategias terapéuticas para remediar la isquemia dentro del sistema nervioso central.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos moleculares que impulsan o impiden la regeneración funcional de los vasos sanguíneos. En el SNC. Se puede utilizar para estudiar el impacto de genes, compuestos farmacológicos o dilucidar los mecanismos patológicos que inician el crecimiento vascular.

Además de las enfermedades oculares, esta técnica se puede extrapolar a otras áreas del SNC, como el cerebro y la médula espinal. Se requiere práctica para inyectar con éxito compuestos en el humor vítreo de los ratones y para manejar cuidadosamente la preparación fresca. Para comenzar, coloque a los cachorros de ratón en P siete y una madre adoptiva CD uno en una cámara de oxígeno configurada al 75% de oxígeno cinco días después, retire a los animales de la cámara y devuélvalos a las condiciones normales de alojamiento. A continuación, en P 12 o P 14, se realizan inyecciones intravítreas para administrar compuestos a la retina interna.

Después de anestesiar a los ratones, verifique la efectividad de la anestesia pellizcando secuencialmente la cola, el pie trasero y la oreja con pinzas. Se debe preparar con anticipación una aguja de vidrio estirada biselada unida a una jeringa de 10 microlitros con una gota de resina epoxi. Ubique el sitio de la inyección en el limbo posterior del ojo.

Inserte la aguja en un ángulo de 45 grados e inyecte el compuesto de interés. Después de aplicar el ungüento en el ojo, devuelva el ratón a la jaula con una madre adoptiva para comenzar a centrifugar la solución de fluoresceína Dexter y recoger el supernat para evitar la constricción de los vasos. Caliente la solución de fluoresceína dextrina antes de inyectar.

A continuación, confirme la profundidad de la sedación en el ratón anestesiado. Cuando esté listo, haga una incisión en la línea media sobre el abdomen con tijeras de disección. Después de abrir la caja torácica y extraer el tejido periférico del corazón, pinza la aorta descendente.

Inserte una aguja de calibre 25 llena de dextrina fluoresceína calentada en el ventrículo izquierdo y perfunda la solución. Dentro de los dos minutos posteriores a la inyección, decapita al animal y coloca la cabeza de lado. Retire la piel y los párpados que cubren el ojo con unas tijeras de disección.

A continuación, coloque pinzas curvas debajo del ojo y tire suavemente de ellas hasta que se corte el nervio óptico. Gire la cabeza del mouse hacia el otro lado y repita estos pasos. Para asegurar una mejor penetración del fijador, perfore un orificio en la cámara anterior del ojo.

Con una aguja de calibre 30, transfiera los ojos a un tubo que contenga 4% de paraform, aldehído y fíjelos durante una hora a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, retire el PFA y lave los ojos cuatro veces con PBS helado. Coloque los ojos en una placa de Petri que contenga PBS frío y colóquelos bajo un microscopio estereoscópico.

Una vez en su lugar, retire cualquier tejido adicional que rodea el ojo con unas tijeras de microdisección y corte la córnea. Use dos pares de pinzas para despegar la esclerótica desde la periferia hacia el nervio óptico. Pellizque la lente con pinzas y extráigala de la copa del ojo.

Use un par de pinzas como soporte y el otro para agarrar y levantar y quitar con cuidado la lente. Separe los vasos aloides de la cara interna de la retina con un cepillo pequeño y pinzas. A continuación, extraiga los haces de vasos hialoides conectados al disco óptico con pinzas.

Transfiera las retinas disecadas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga PBS y colóquelas en hielo. Antes de comenzar el procedimiento de tinción, las retinas disecadas se incuban primero durante la noche con una suave agitación a cuatro grados centígrados. En una solución, una iso selectina B 4 acoplada con fluorescencia que contiene cloruro de calcio Durante todo el procedimiento de tinción, los tubos deben cubrirse con papel de aluminio para protegerlos de la luz al día siguiente.

Retire la solución de tinción y lave las retinas tres veces en PBS durante 10 minutos. A temperatura ambiente, transfiera la retina con el lado fotorreceptor hacia abajo a un microscopio. Deslízalo mientras refuerzas la retina con un cepillo.

Realice cuatro incisiones radiales equidistantes profundas. Con un bisturí quirúrgico, aplanar cuidadosamente los cuadrantes y sumergir la retina en el medio de montaje para el fotoblanqueo, colocar con cuidado un cubreobjetos en la superficie de la retina montada sin aplicar presión y evitando las burbujas de aire. Finalmente, se toman imágenes y se cuantifican las diapositivas.

Para la vasoobliteración, se observó un aumento dependiente de la dosis en la regeneración vascular después de la inyección de Trin one a P 14 y rebrote. Evaluado en P 17: los vasos con función de barrera comprometida fugan fluorescencia después de la profusión con una dextrina fluorescente después de una inyección intravítrea de lentivirus. En P tres, la inhibición de IRE uno alfa mejoró drásticamente la regeneración vascular en la fase de crecimiento vascular en P 17.

Una vez que se dominan estas técnicas, la inyección intravítrea, la perfusión cardíaca y la extracción de retina deberían durar unos 10 minutos cada una si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante preservar la estructura 3D del ojo, evitar una presión excesiva que pueda dañar la retina y comprometer los resultados. No olvide que trabajar con animales, virus o compuestos bioactivos puede ser extremadamente peligroso.

Siempre se deben usar precauciones de seguridad y herramientas esterilizadas mientras se realiza este procedimiento.