La reconstitución de la degradación de β-catenina en Xenopus Extracto de Huevo

Se describe un método para el análisis de la degradación de proteínas usando radiomarcado y proteínas de fusión luciferasa-en extracto de huevo de Xenopus y su adaptación para la selección de alto rendimiento para moduladores de moléculas pequeñas de la degradación de proteínas.

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar el sistema bioquímico de extracto de huevo de xenopus libre de células para analizar el recambio de beta catina. Esto se logra primero agregando y/o agotando los efectores sospechosos al extracto de huevo xip activado con el fin de identificar los moduladores del recambio de beta-catenina como un segundo paso exógeno in vitro, se transcribe y traduce beta-catenina, ya sea radiomarcada con S 35 o fusionada con luciferasa se agrega al extracto de huevo XUS, que se degrada activamente en condiciones nativas. A continuación, recopile puntos de tiempo para evaluar los cambios en los niveles de beta katina y proteínas a lo largo del tiempo.

Se obtienen resultados que muestran si una modulación particular del extracto de huevo de xenopus aumenta o disminuye las tasas de beta catina y degradación en función de la autorradiografía y/o la detección de luminiscencia. La ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes, como los experimentos de persecución por pulso o persecución de cíclicos en células cultivadas, es que el extracto de óvulo de xenopus proporciona un sistema bioquímico libre de células en el que se puede analizar la regulación de proteínas a nivel de proteínas, y carece de la complejidad añadida de la transcripción activa. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la transducción de señales mediante la identificación de reguladores de proteínas de señalización clave como la beta catina.

Trabajar con extracto de xenopus permite al usuario agotar fácilmente los componentes de una vía y volver a agregar una cantidad definida de una proteína. Para determinar sus efectos dependientes de la dosis, use extracto de huevo XUS recién preparado o descongele rápidamente, extracto congelado y colóquelo en hielo. Realice todas las manipulaciones en frío, prepare perlas de anticuerpos o de afinidad granuladas a una décima parte del volumen del extracto para minimizar la dilución del extracto, retire la mayor cantidad de líquido posible de las perlas antes de agregar el extracto.

Usando puntas de carga de gel con extremos largos y cónicos, aquí el extracto se agrega a la resina aglutinante GST. Gire la mezcla de perlas de extracto a cuatro grados centígrados durante una hora. A continuación, centrifugar la mezcla de perlas de extracto a 12.600 Gs en una micro fuga a cuatro grados centígrados durante 30 segundos.

Teniendo cuidado de no transferir ninguna perla con el extracto. Transfiera el extracto agotado a un tubo de micro fuga fresco sobre hielo. Confirmar la eficacia de la depleción por inmunotransferencia, tanto el extracto empobrecido como las perlas.

Debido a que el T y la degradación dependen de la energía, agota rápidamente las reservas endógenas de A TP. En consecuencia, para mantener una degradación robusta de T, debe utilizar una mezcla de regeneración de energía. Prepare una mezcla de 20 veces la regeneración de energía o ER como se detalla en el protocolo de texto.

Descongele rápidamente el extracto de huevo opus frotando el tubo congelado entre las manos. Coloque el tubo en hielo justo antes de que todo el extracto se haya derretido. Añadir 10 microlitros de regeneración de energía.

Mezclar en una alícuota de extracto de huevo de xenopus. Mezcle bien moviendo rápidamente el tubo y el pulso de vórtice de pulso, gire e inmediatamente colóquelo en hielo. Alícuota los volúmenes apropiados para el ensayo de degradación en tubos de micro fuga preenfriados sobre hielo.

Para prepararse para los ensayos de beta katina y degradación, extraiga de dos a cinco microlitros de extracto por cada punto de tiempo para realizar el ensayo de degradación de beta-catenina marcado por radio en el extracto de huevo XUS. Primero, prepare la radio etiquetada como beta-catenina como se describe en el protocolo de texto. A continuación, añada de uno a tres microlitros de beta-catenina traducida in vitro a 20 microlitros de mezcla de reacción xip sobre hielo, mezcle bien con un rápido movimiento del tubo y un breve pulso de vórtice.

Este es un paso importante. Un extracto de huevo XUS es muy viscoso y la mezcla incompleta afectará la consistencia de los resultados pulso, centrifugado y colocación en hielo. Inicie la reacción de degradación de la beta-catenina desplazando los tubos a temperatura ambiente en el punto de tiempo designado.

Retire de uno a cinco microlitros de la muestra y mezcle inmediatamente con un volumen de cinco veces el volumen de tampón de muestra SDS para detener la reacción y asegurarse de que la reacción de degradación haya terminado por completo. Golpee el tubo varias veces y haga un vórtice vigoroso para realizar la página SDS. La radiografía automática ejecuta una equivalencia de un microlitro del extracto por cada punto de tiempo por carril.

Los resultados se pueden cuantificar utilizando image, J image quant u otro software de imagen preferido. La degradación de la beta-catenina en el extracto de huevo xap debe ser evidenciada por la disminución dependiente del tiempo en la intensidad de la beta kaína marcada con radio en la banda. Para preparar la beta-catenina luciferasa sintetizar beta-catenina marcada con luciferasa no radiomarcada.

Utilizando el sistema acoplado de traducción de transcripción con mezcla completa de aminoácidos. Confirmar la producción de beta-catenina marcada con luciferasa midiendo la actividad de la luciferasa de 0,5 a un microlitro de la reacción. Evalúe la luminiscencia de fondo midiendo la luminiscencia de una mezcla de reacción no traducida para realizar el ensayo de degradación de la luciferasa beta catina: primero descongele y prepare el extracto de huevo de xenopus como antes.

A continuación, añada la fusión de beta catina y luciferasa traducida in vitro en la reacción xip preparada. Mezcle con hielo y mezcle bien. Al igual que antes, cambie el extracto a temperatura ambiente para iniciar la reacción de degradación.

Retire una alícuota de la reacción en el punto de tiempo indicado y congele rápidamente en nitrógeno líquido. Retire las muestras por triplicado para su análisis en cada punto de tiempo. El extracto congelado se puede almacenar a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para ser analizado.

Descongele las muestras en hielo y transfiéralas a placas blancas estándar de 96 pocillos en hielo antes de procesarlas. En cuanto a la actividad de la luciferasa, la degradación de la beta-catenina dependiente de GS GSK tres puede demostrarse fácilmente de múltiples maneras utilizando el extracto de huevo XUS. La degradación de la beta-catenina marcada con radio S 35 en el extracto de XUS se inhibe mediante la adición del inhibidor del proteasoma MG 1 32.

El mutante de beta-catenina se estabiliza en el extracto de huevo XUS en relación con la betaína de tipo salvaje y los inhibidores de proteínas de GSK tres inhiben de manera similar la degradación de la beta-catenina. Finalmente, el agotamiento de GSK tres del extracto de huevo xip inhibe la degradación de la degradación de la beta-catenina se puede rescatar mediante la adición de GSK tres exógenos. Se utilizó el ensayo de degradación de la beta-catenina luciferasa en extracto de huevo xip para evaluar la degradación de la beta katina y la luciferasa.

La tasa de degradación de la beta katina y la luciferasa es similar a la de la proteína beta-catenina no marcada. La regulación de la degradación para la fusión de beta katina y luciferasa es esencialmente idéntica a la proteína de no fusión. Como la adición de cloruro de litio resultó en la inhibición de la beta catina y la luciferasa, cambios en el recambio en la señal radiactiva de la beta catina.

La proteína luciferasa es paralela a los cambios en la actividad enzimática de la luciferasa a lo largo del tiempo mientras se intenta este procedimiento. Es importante mantener todos los reactivos en hielo y mezclar bien las reacciones antes de intentar este ensayo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo identificar los reguladores y analizar la beta catina y el recambio utilizando el sistema de extracto de óvulo de xenopus libre de células.