Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

El objetivo general de este experimento es medir directamente las deformaciones torsionales o los cambios en la torsión de las moléculas de ADN bicatenario a nivel de una sola molécula. Esto se logra utilizando dos ensayos, en el primer ensayo se denominan pinzas magnéticas de órbita libre o golpeadas. Una sola molécula de ADN funcionalizada está atada entre una perla magnética y una superficie de vidrio.

Mientras que un imán de forma cilíndrica ejerce una fuerza que estira el ADN, en esta configuración, la posición angular de las cuentas solo está restringida por el ADN atado, no por el imán, lo que permite que la rotación de la cuenta, como se muestra en la flecha roja, informe sobre los cambios en la torsión del ADN, las fluctuaciones térmicas rotacionales de la causa de la cuenta. Su posición XY para acostarse en un anillo circular o rosquilla. La conversión de esta posición XY en ángulo de rotación hace posible monitorear los cambios en la torsión del ADN atado en un segundo ensayo relacionado llamado pinzas de torque magnético, o se agrega un imán lateral MTTA al imán cilíndrico principal para restringir el movimiento angular de las cuentas.

Con esta configuración de imán, se pueden aplicar pares externos a la molécula de ADN atada a través de una simple rotación del conjunto del imán, mediciones de la desviación de la posición angular de las cuentas después de aplicar un número de vueltas en comparación con su configuración inicial relajada torsionalmente, junto con la calibración de la rigidez de la trampa magnética que confina las cuentas, El movimiento angular permite cuantificar la acumulación de par en el ADN. La principal ventaja de utilizar la fuente y el MTT frente a las pinzas magnéticas convencionales es que podemos medir directamente el par y los cambios en la torsión de los ácidos nucleicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la mecánica del ADN y el ARN al permitirnos trazar sus respuestas a fuerzas y pares externos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden al sondeo de las interacciones del ADN con las proteínas. Por ejemplo, las proteínas responsables de la reparación del ADN, el almacenamiento o la transcripción La demostración visual de este método ilustra la facilidad con la que se puede modificar una pinza magnética convencional para darle nuevas capacidades. La configuración utilizada para los siguientes experimentos se basa en una configuración convencional de pinzas magnéticas.

En su centro hay una celda de flujo iluminada desde la parte superior por un LED y fotografiada a través de un objetivo de microscopio y una cámara CCD desde abajo. Encima de la celda de flujo hay una cabeza magnética que se puede mover hacia arriba y hacia abajo y girar mediante motores controlados por computadora. Las imágenes de la cámara CCD se analizan en tiempo real mediante un software de vista de laboratorio personalizado para determinar la posición X, Y y Z de las cuentas atadas al ADN.

El software de vista de laboratorio personalizado está disponible a través de los autores a pedido. Después de preparar una celda de flujo con perlas magnéticas atadas a ADN, montarla en las pinzas magnéticas convencionales y seleccionar una superficie inmovilizada para el cordón de referencia y un cordón al que se ata una molécula de ADN individual de la longitud adecuada. La configuración se puede convertir al modo de fuente.

Comience desenroscando manualmente la cabeza del imán completa que sostiene el imán para la configuración de pinzas convencional. Reemplácelo con la cabeza del imán que sostiene un imán cilíndrico para la fuente. Al colocar el imán cilíndrico utilizado para F en la cabeza del imán, asegúrese de mantener la correa de ADN seleccionada dentro del campo de visión.

El aspecto más difícil de este procedimiento es alinear correctamente los imanes para la geometría de la forma. Una buena alineación se logra moviendo sistemáticamente los imanes y probando la alineación después de cada paso, lo que demostraremos. Ahora, realice una alineación de curso del imán en la fuente utilizando las etapas de posición para mover manualmente los imanes en el software de vista de laboratorio.

Haga clic en el botón de grabación para medir las fluctuaciones o excursiones de la posición XY. Las trazas registradas se muestran en la pantalla en tiempo real y se guardan como archivos de texto que contienen la información de posición X, Y, Z. Si las excursiones XY siguen un arco como se muestra aquí, el imán cilíndrico no está alineado correctamente, continúe moviendo el imán cilíndrico en la dirección adecuada y tomando medidas hasta que las fluctuaciones XY tracen un patrón circular completo, lo que indica que se ha logrado la alineación del curso. Próximo.

Si es necesario para experimentos adicionales, realice una alineación fina en la fuente mediante el uso de una etapa automatizada de alta resolución para mover la celda de flujo, alineando el imán cilíndrico dentro de aproximadamente 10 micras del cordón. Luego, como antes, registre las excursiones XY. Continúe moviendo el escenario y grabando las excursiones hasta que las fluctuaciones en el anillo circular sean casi uniformes.

Para verificar la alineación final, utilice un script de MATLAB que los autores puedan solicitar para trazar las fluctuaciones en un histograma o un termograma e inspeccionar su uniformidad. Para tomar medidas del par de ADN, retire el imán cilíndrico que se utiliza para la fuente y reemplácelo con un imán cilíndrico más un imán lateral permanente. Para el MTT, asegúrese de que el lazo de ADN seleccionado permanezca dentro del campo de visión.

Introduzca el número y la velocidad de las vueltas magnéticas en el panel correspondiente del software de control de vista de laboratorio. Aquí. El número de vueltas se establece en cinco y la velocidad se establece en 0,1 hercios. Esto hará que los imanes giren lentamente durante la medición.

A continuación, en matlab, utilice un script de seguimiento angular basado en la supervisión de la posición XY, que está disponible a petición del autor. Aparecerá un gráfico que muestra las fluctuaciones angulares en función del tiempo, theta T. Una vez que todo esté configurado en la vista de laboratorio, haga clic en el botón de grabación.

Los rastros aparecerán en tiempo real como antes. En matlab, utilice el script de MATLAB para producir gráficos de ángulo theta T y altura de cuenta Z de T en la pantalla con un ajuste gaussiano a la señal de ángulo para determinar la desviación estándar de las fluctuaciones angulares. Sigma theta.

Este script determina directamente la rigidez de la trampa torsional a partir de la varianza de las fluctuaciones angulares. Sigma theta al cuadrado en radianes. Usando la fórmula que se muestra aquí, tenga en cuenta que es típico en el MTT lograr una rigidez de trampa rotacional de 10 a 1000 picos newton nanométricos por radián, que es mucho menor que en las pinzas magnéticas convencionales.

Aquí, por ejemplo, hemos determinado que la rigidez de la trampa rotacional es de aproximadamente 52 nanómetros pig por radián. La rigidez de la trampa rotacional de las pinzas de par magnético en comparación con las pinzas magnéticas convencionales las hace adecuadas para mediciones de par de una sola molécula, pero también significa que se reduce el par máximo que se puede ejercer. Esto implica que el MTT no puede contrarrestar los pares de arrastre causados por la rotación rápida.

Por lo tanto, se debe tener cuidado de no girar demasiado rápido. Por lo general, rotamos a velocidades de aproximadamente 0,1 hercios. A continuación, la correa de ADN se sobrecarga girando lentamente los imanes, un número determinado de vueltas, y registrando otra traza de fluctuaciones angulares, el número y la tasa de vueltas del imán se ingresan nuevamente en el panel correspondiente del software de vista de laboratorio de control.

Aquí el número de vueltas se establece en 40 y la velocidad se establece en 0,1 hercios. Esto hará que los imanes giren lentamente durante la medición para determinar el par acumulado en la correa de ácido nucleico. Después de N vueltas, usamos la fórmula que se muestra aquí donde los corchetes angulares denotan el promedio y theta cero.

Y theta N son el ángulo en las vueltas cero que corresponden a una correa y vueltas relajadas a la torsión respectivamente. Repita los pasos en los que se giran los imanes y registre una meseta de fluctuaciones angulares según sea necesario para determinar completamente la respuesta de toque de una molécula en una sola ejecución de medición. Medir los cambios en la torsión del ADN inducidos por la proteína de reparación RAD 51, cuya unión al ADN bicatenario se alarga y se desenrolla.

El ADN rad 51 se añadió a una molécula de ADN atada a la fuente. Como se muestra aquí, la cuenta traza una trayectoria en espiral. Este movimiento se puede desacoplar en componentes que describen cómo el ADN se alarga y se desenrolla con el tiempo.

Para medir el par almacenado en el ADN utilizando el MTT, se midió la molécula con bobinado por encima y por debajo y las fluctuaciones angulares para cada número de vueltas aplicadas. La desviación estándar de las fluctuaciones angulares, que informa sobre la rigidez de la trampa angular, debe ser independiente del número de vueltas aplicadas. Aquí, la desviación estándar es de aproximadamente nueve grados, como se muestra aquí.

La media de las posiciones angulares cambia sistemáticamente con el número de vueltas aplicadas utilizando la rigidez constante de la trampa angular. Los cambios en el ángulo medio se convierten en torque, produciendo el torque almacenado en el ADN frente a las vueltas aplicadas. El registro simultáneo de la posición Z de las cuentas produce la longitud del ADN en comparación con los giros aplicados.

Juntas, estas dos curvas producen la respuesta mecánica completa del ADN al enrollado excesivo y subalterno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir, torcer y torcer moléculas biológicas utilizando las pinzas magnéticas de órbita libre y las pinzas de torque magnético para nuevos ensayos de moléculas individuales a los que las pinzas magnéticas convencionales se pueden adaptar fácilmente. El desarrollo de estas técnicas allana el camino para la investigación en el campo de la biofísica, por ejemplo, para estudiar las propiedades de torsión del ADN o el ARN y observar procesos como la compactación y reparación del ADN.