Análisis Phosphopeptide de roedores epidídimo Espermatozoides

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar los cambios en los péptidos fosfopédicos que ocurren dentro de los espermatozoides durante la maduración de los espermatozoides. Esto se logra eliminando el epidídimo mimoso del ratón, realizando un lavado retrógrado de los espermatozoides y recogiendo las células en un tubo microcapilar. A continuación, se permite que los espermatozoides naden en una solución salina equilibrada, lo que permite la eliminación de las proteínas contaminantes, y luego se lavan y precipitan para eliminar las sales y grasas contaminantes.

Las proteínas gulares se digieren con tripsina y luego se enriquecen con dióxido de titanio para enriquecer los péptidos de fosfo. Los resultados muestran cambios cuantitativos en el estado de fosforilación de proteínas basados en cromatografía líquida, análisis de espectrometría de masas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología reproductiva, como cuáles son los cambios fosfoproteómicos a medida que los espermatozoides atraviesan los EPI o durante la capacitación.

Aunque este método ha proporcionado una visión de la biología de los espermatozoides, también se puede aplicar a organismos modelo, estudios de enfermedades como el cáncer, patologías neurológicas y vías generales de transducción de señales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que es difícil determinar la anatomía de las áreas en las que se manipularán los EPI. Comience haciendo 200 mililitros de solución de tallo de trabajo Biggers, Whitten and Whitten o BWW agregando lo siguiente a un litro de agua Milli Q para hacer una cánula.

Utilizando tubería de polietileno con diámetros internos y externos de 0,4 milímetros y 1,1 milímetros respectivamente. Manténgalo a fuego lento hasta que el tubo comience a derretirse. Tire inmediatamente de los extremos del tubo hacia afuera para estirarlo, disminuyendo así el diámetro exterior.

Corte el tubo para producir un estrechamiento de un extremo, lo que permitirá una canulación más fácil de los S. Corta el extremo opuesto a aproximadamente 15 centímetros. A continuación, inserte una aguja de calibre 30 en el extremo romo y coloque una jeringa de tres mililitros completamente retraída.

Haga una boquilla de succión cortando un tubo de PE de 20 centímetros de longitud e insértelo en un extremo de la cánula. Inserte el soporte del tubo de vidrio microcapilar y el microcapilar de vidrio. Después de sacrificar a un ratón de acuerdo con el protocolo de texto, haga una pequeña incisión en el escroto para exponer el epi.

Entonces usa un par de relojeros. Número cinco pinzas para extraer el testículo y el epidídimo de la cavidad. Cortar para eliminar todo, excepto uno o dos centímetros de la vasta deferencia del kata epidídimo.

A continuación, corte para extraer los conductos proximales de EENT y el tejido que conecta el epidídimo con el testículo y extraiga toda la pista reproductiva masculina bajo un microscopio de disección utilizando un aumento de entre cinco y 40 aumentos. Coloque uno o dos centímetros del extremo estrecho de la cánula en el campo de visión y use cinta adhesiva para asegurarlo con la pinza de relojero número cinco. Sujete suavemente cada lado de la vasta deferencia y tire de ella sobre la parte visible de la cánula.

Luego, con seda tratada trenzada negra no absorbible, haga un nudo seguro alrededor del tejido canulado con relojeros. Pinzas número cinco. Agarra el extremo distal de los kata epi ides y retira la túnica Eugenia.

Para exponer un solo túbulo epidérmico, exponga suavemente el túbulo y sepárelo para crear una abertura para que se liberen los espermatozoides. A continuación, presione suavemente el émbolo de la jeringa para expulsar el aire en la vasta deferencia. La presión hará que los espermatozoides salgan del túbulo roto.

A continuación, aplique la succión a la boquilla para atraer los espermatozoides hacia el capilar de vidrio. Sople suavemente en la boquilla o coloque una jeringa y expulse los espermatozoides del capilar de vidrio en un mililitro de solución B WW de antes de la guerra. Y use la solución para lavar las células tres veces para eliminar cualquier proteína contaminante.

Después de eliminar el lavado final, congele el esperma para su uso posterior o use 4% de chaps, dos molares de tio urea y 50 milimolares tris pH 7.4 para solubilizar las proteínas incubadas durante una hora con vórtice intermitente. A continuación, centrifugar la solución a 10.000 GS durante 20 minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo para reducir los enlaces disulfuro y alquilar las proteínas en DTT a una concentración final de 10 milimolares a la solución proteica. Agitar e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, añada 50 milimolares de acetamida IO al vórtice de lisado e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para precipitar las proteínas, combine un volumen de lisado, un volumen de metanol y 0,5 volúmenes de cloroformo. Después de vórtice la muestra, gírela a 10, 000 Gs durante dos minutos, recoja la capa superior, dejando unos dos milímetros para evitar aspirar la interfaz.

Después de agregar un volumen de metanol, invierta suavemente el tubo y vuelva a girar. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet durante tres o cuatro minutos para llevar a cabo la tripsina, la digestión y el enriquecimiento de fosfopéptidos. Comience usando bicarbonato de amonio de 25 milimolares que contenga urea molar.

Para reconstituir la tripsina, combine F 50 a una proporción de peso por peso de proteína a la tripsina e incube en un termomezclador a 37 grados Celsius y 700 RPM durante la noche. Después de girar para pellets el material no digerido, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Usando tampón DHB preparado de acuerdo con el protocolo de texto, diluya los péptidos inizados intentados diez veces y aplíquelo a 200 microgramos de perlas de dióxido de titanio secas incube en un rotador durante una hora a temperatura ambiente después de la incubación, use tampón DHB para lavar la muestra una vez más antes de usar tampón de lavado que consta de 80% A CN y 2% TFA para lavar la muestra tres veces después de la centrifugación final eluir los péptidos fosfopédicos por añadiendo un 2,5% de hidróxido de amonio inmediatamente después de girar y recoger el sobrenadante.

Utilice 0,3 microlitros de ácido fórmico para acidificar la muestra como se ve aquí. Una ventaja de este protocolo es que los espermatozoides están aislados. En un estado de reposo, muchas células se agrupan justo después de la expulsión al medio B WW.

Sin embargo, después de 10 minutos, se vuelven modales y la solución se vuelve homogénea. La preparación descrita en este video generalmente produce 200 veces 10 por las seis zoa. Esta figura demuestra la pureza de los espermatozoides de la rata AR Cota epididymus.

Un problema importante con respecto a la preparación de muestras es el rendimiento de los viajes y la digestión. A diferencia de la precipitación de TCA, que a menudo requiere que se ajuste el pH de la muestra, la precipitación de fenol cloroformo es rápida y no acidifica. Aquí está la reproducibilidad de este protocolo.

Las rayas azules que aparecen con el tiempo son péptidos alusivos a una nano columna de C 18. A medida que aumenta la concentración de acetonitrilo en la población modal, hay un grupo de péptidos a unos 651,5 Daltons que está completamente ausente en el rango no especial. Una vez finalizado el protocolo de enriquecimiento de péptidos fosfatados es una técnica eficiente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la preparación de la muestra es un aspecto clave para obtener resultados reproducibles para la proteómica. Este método se puede adaptar para aislar glicoproteínas, lo que se puede utilizar para responder preguntas adicionales, como qué proteínas sufren un cambio en el contenido de ácido sic de su proteoma.