4.11: Electroporación in ovo de embriones de pollo

La electroporación es una técnica utilizada para introducir material genético extraño en las células. La electroporación de embriones de pollo dentro del huevo, o electroporación in ovo, es una herramienta valiosa para los biólogos del desarrollo porque la entrega de material genético puede localizarse en tejidos específicos y puntos temporales de desarrollo específicos. Este video presentará los principios básicos de la electroporación in ovo, describirá los pasos esenciales del procedimiento y discutirá cómo se puede usar esta técnica para estudiar los procesos biológicos durante el desarrollo.

Para empezar, repasemos los principios básicos de la electroporación para averiguar cómo se puede utilizar para introducir ADN en una célula.

En primer lugar, la microinyección se utiliza para entregar el ADN muy cerca de una célula de interés. Sin embargo, el ADN no puede penetrar en la membrana plasmática para entrar en la célula.

Para resolver este problema, se aplica una corriente eléctrica que altera la estabilidad de la membrana, creando poros. Una segunda consecuencia de este campo eléctrico es la migración del ADN cargado negativamente hacia el electrodo positivo. Como resultado, solo las células en el lado del sitio de inyección más cercano al electrodo positivo se transfectan con el ADN.

Ahora que conoces los principios básicos, hablemos de cómo preparar los embriones para la electroporación. Si necesita utilizar embriones mayores que la etapa 20 de Hamburger Hamilton, es mejor cultivar sus pollitos fuera de la cáscara, o ex ovo, para mejorar el acceso al tejido. Este video se centrará en las electroporaciones realizadas en embriones tempranos que se desarrollan dentro de la cáscara, o en ovo.

Para empezar, los huevos deben incubarse en una incubadora humidificada a los 37 ? C hasta que hayan alcanzado la etapa de desarrollo deseada. Mientras se incuban los huevos, prepare las herramientas para la inyección y la electroporación. En primer lugar, haga agujas capilares tirando de una pipeta de vidrio de 0,5 mm con un extractor de pipetas. Para abrir la pipeta, colóquela bajo un microscopio y rompa un pequeño trozo de la punta. Luego, prepare la solución inyectable, que debe contener una dilución adecuada de su construcción, así como un tinte para ayudarlo a visualizar la solución inyectada.

Para controlar el movimiento del líquido dentro de la aguja, conéctela a una pipeta bucal accionada por humanos. Alternativamente, la aguja se puede cargar en un microinyector, que proporciona pulsos de aire de presión ajustable. Llene la aguja sumergiendo la punta en la solución inyectable y aplicando presión negativa.

Además de agujas, también necesitará electrodos. Estos consisten en dos cables expuestos fijados entre sí por un adaptador. Un par de cables conecta los electrodos al generador de pulsos eléctricos, o electroporador, que controla la duración, la frecuencia y el voltaje del pulso. Para el funcionamiento manos libres, el electroporador se puede activar mediante un pedal.

Una vez que los huevos estén listos, corta una ventana en la cáscara y agrega unas gotas de solución salina fisiológica, como Hanks, para evitar que el embrión se seque. Bajo un microscopio, coloque el óvulo de manera que el tejido de interés sea accesible a la aguja. A continuación, perfora el embrión con la aguja capilar y libera la solución aplicando una presión suave.

Ahora que hemos inyectado el constructo, es hora de realizar la electroporación. Coloque los electrodos de modo que queden sumergidos en la solución de Hank y el tejido de interés quede centrado entre ellos. Para aplicar la corriente eléctrica, presione el pedal y busque las burbujas que se forman alrededor de los electrodos.

Una vez completada la electroporación, retira los electrodos del embrión y límpialos con etanol al 70%. Agregue unas gotas de solución salina complementada con antibióticos para prevenir infecciones y selle la ventana con cinta adhesiva. Finalmente, vuelva a colocar los huevos en la incubadora para un desarrollo continuo antes del análisis fenotípico.

Ahora que hemos aprendido todo sobre la electroporación in ovo, veamos algunos ejemplos de cómo los científicos están aplicando esta técnica en la investigación del desarrollo.

Para empezar, la electroporación se puede utilizar para bloquear la expresión génica mediante la administración de construcciones de derribo. En este ejemplo, las células del tubo neural en desarrollo fueron electroporadas con construcciones de silenciamiento génico. Se permitió que los embriones se desarrollaran, y luego se compararon las trayectorias de los axones entre muestras normales y derribadas para evaluar el control genético de la guía de los axones.

Por otro lado, la electroporación in ovo también se puede utilizar para expresar una proteína en un subconjunto de células mediante la introducción de un plásmido que contiene un gen codificador de proteínas y un promotor: una secuencia que se une a la ARN polimerasa para iniciar la transcripción. Aquí, los científicos introdujeron un solo gen en las células del cerebro embrionario. La tinción tisular para detectar tanto el producto proteico de este gen como los marcadores de subtipos neurales específicos muestra que el gen electroporado altera el desarrollo neuronal.

Las construcciones de ADN que codifican proteínas fluorescentes también se pueden introducir por electroporación para visualizar células y estructuras durante el desarrollo. Esto permite obtener imágenes en vivo de procesos complejos, como el desarrollo de la médula espinal, lo que brinda información sobre la dinámica de los movimientos celulares a lo largo del tiempo.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la electroporación in ovo, una técnica útil para administrar material genético en pollitos. Este video discutió los principios básicos de la electroporación, los pasos necesarios para inyectar y electroporar pollitos y las aplicaciones de esta técnica en la investigación actual sobre el desarrollo. ¡Gracias por mirar!