JoVE Science Education

Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Electroporación in ovo de embriones de pollo

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

In ovo Electroporation of Chicken Embryos

4.10: Mouse Genotyping

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

24,773 Views

•

06:57 min

•

April 30, 2023

Overview

La electroporación es una técnica utilizada en la investigación biomédica que permite la manipulación de la expresión génica mediante la entrega de material genético extraño en las células. Concretamente, se realiza en ovo electroporación en pollitos en desarrollo tempranos (domesticus del Gallus de gallus) dentro de sus cáscaras de huevo. En este procedimiento, ADN o derribo de construcciones primero se inyecta en un tejido diana. Sin embargo, el material genético es incapaz de penetrar la membrana del plasma para llevar a cabo su función dentro de la célula. Para resolver este problema, se aplica un campo eléctrico, causando interrupciones temporales para la estabilidad de la membrana. Este campo eléctrico también provoca que los ácidos nucleicos cargados negativamente que migran hacia el electrodo cargado positivamente a través de los agujeros en la membrana plasmática, así con eficacia conduciendo el ADN o construcción de precipitación en la célula. La principal ventaja de esta técnica es que la entrega de material genético puede ser localizada a tipos de la célula aislada en momentos específicos de desarrollo. Como resultado, pueden examinarse los mecanismos genéticos que rigen los acontecimientos individuales del desarrollo.

Este video ofrece una visión general de los principios de electroporación de ovo y presenta las herramientas necesarias para la técnica, incluyendo agujas capilares, electrodos y un electroporator. También se presenta un protocolo paso a paso para llevar a cabo el procedimiento antes de la discusión de algunos fascinantes ejemplos de cómo la técnica se utiliza para realizar una variedad de manipulaciones genéticas en embriones de pollo.

Procedure

La electroporación es una técnica utilizada para introducir material genético extraño en las células. Electroporación de embriones dentro del huevo o de ovo electroporación, es una herramienta valiosa para los biólogos del desarrollo porque la entrega de material genético se puede localizar en tejidos específicos y puntos de tiempo específicos de desarrollo. Este vídeo introduce los principios básicos de la electroporación en ovo , describir pasos esenciales del procedimiento y discutir cómo se puede utilizar esta técnica para estudiar procesos biológicos durante el desarrollo.

Para empezar, vamos a repasar los principios básicos de la electroporación para averiguar cómo puede utilizarse para obtener DNA en una célula.

En primer lugar, microinyección utiliza para entregar el ADN en proximidad cercana a una celda de interés. Sin embargo, el ADN no puede penetrar la membrana plasmática en la célula.

Para resolver este problema, se aplica una corriente eléctrica para perturbar la estabilidad de la membrana, creando poros. Una segunda consecuencia de este campo eléctrico es la migración del ADN cargado negativamente hacia el electrodo positivo. Como resultado, solamente las células en el sitio de inyección más cercano para el electrodo positivo ser transfectadas con el ADN.

Ahora que conoces los principios básicos, vamos a hablar de cómo preparar los embriones para la electroporación. Si usted necesita utilizar embriones mayores de la etapa 20 de la hamburguesa de Hamilton, es mejor a sus chicas fuera de la cáscara, o ex ovo, acceso mejorado del tejido de la cultura. Este video se centrará en electroporations realizado en embriones tempranos dentro de la concha, o de ovo.

Para empezar, los huevos deben ser incubados en un incubador humedecido a 37 ° C hasta que hayan alcanzado la etapa de desarrollo deseada. Mientras están incubando los huevos, preparar las herramientas para la inyección y electroporación. En primer lugar, hacer agujas capilares tirando una pipeta de vidrio de 0,5 mm con un tirador de la pipeta. Para abrir la pipeta, colocar bajo un microscopio y romper un pedazo pequeño de la punta. A continuación, preparar la solución de la inyección, que debe contener una dilución de su construcción, así como un tinte para ayudar a visualizar la solución inyectada.

Para controlar el movimiento del líquido dentro de la aguja, conéctelo a una pipeta de boca de propulsión humana. Alternativamente, la aguja se puede cargar en un microinyector, que proporciona pulsos de presión de aire. Llenar la aguja sumergiendo la punta en la solución de la inyección y aplicar presión negativa.

También necesitarás además de agujas, electrodos. Éstos consisten en dos alambres expuestos fijados junto con un adaptador. Un par de cables conecta los electrodos al generador de impulsos eléctricos o electroporator, que controla la duración del pulso, la frecuencia y el voltaje. Para la operación libre de las manos, el electroporator puede ser activado por un pedal.

Una vez que los huevos están listos, cortar una ventana en la cáscara y añadir unas gotas de solución salina fisiológica, como madejas, para evitar que el embrión de la desecación. Bajo el microscopio, coloque el huevo, que es accesible a la aguja el tejido de interés. Luego perforar el embrión con la aguja capilar y ofrecer una solución mediante la aplicación de presión suave.

Ahora que hemos inyectado la construcción, es tiempo para realizar la electroporación. Coloque los electrodos que están sumergidos en solución de Hank y el tejido de interés está centrado en el entre ellos. Para aplicar la corriente eléctrica, presione el pedal de pie y mirar a las burbujas que se forman alrededor de los electrodos.

Una vez completada la electroporación, retirar los electrodos del embrión y limpie con etanol al 70%. Añadir unas gotas de solución salina suplementada con antibióticos para prevenir la infección y sellar la ventana con cinta adhesiva. Por último, vuelva a colocar los huevos en la incubadora para desarrollo continuo antes del análisis fenotípico.

Ahora que hemos aprendido todo acerca de ovo electroporación, echemos un vistazo a algunos ejemplos de cómo los científicos están aplicando esta técnica en la investigación del desarrollo.

Para empezar, electroporación puede utilizarse para bloquear la expresión del gen por la entrega de construcciones de precipitación. En este ejemplo, las células del tubo neural en desarrollo eran electroporated con construcciones de silenciamiento del gen. Los embriones se les permitiera desarrollar y luego trayectorias del axón se compararon entre muestras normales y precipitación para evaluar el control genético de la orientación del axón.

En la otra cara, en ovo electroporación puede utilizarse también para expresar una proteína en un subconjunto de las células mediante la introducción de un plásmido que contiene un gen de codificación de proteínas y un promotor: una secuencia que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción. Aquí, los científicos entregaron un solo gen en las células del cerebro embrionario. Tejido de tinción para detectar tanto el producto de la proteína de este gen y los marcadores de subtipos neuronales específicos muestran que el gen de la electroporated altera el desarrollo neuronal.

Construcciones de ADN que codifican proteínas fluorescentes también se pueden introducir por la electroporación para visualizar las células y estructuras durante el desarrollo. Esto permite la proyección de imagen viva de procesos complejos, tales como el desarrollo de la médula espinal, dando información sobre la dinámica de los movimientos celulares en el tiempo.

Sólo ha visto introducción de Zeus que en ovo electroporación, una técnica útil para la entrega de material genético en pollitos. Este video discute los principios de electroporación, electroporate pollitos y pasos necesarios para inyectar y aplicaciones de esta técnica en la investigación del desarrollo actual. ¡Gracias por ver!

Transcript

Electroporation is a technique used to introduce foreign genetic material into cells. Electroporation of chick embryos inside the egg, or in ovo electroporation, is a valuable tool for developmental biologists because the delivery of genetic material can be localized to specific tissues and specific developmental time points. This video will introduce the basic principles of in ovo electroporation, describe essential steps of the procedure, and discuss how this technique can be used to study biological processes during development.

To start, let’s review the basic principles of electroporation to figure out how it can be used to get DNA into a cell.

First, microinjection is used to deliver the DNA in close proximity to a cell of interest. However, the DNA can’t penetrate the plasma membrane to get into the cell.

To solve this problem, an electrical current is applied to disrupt the stability of the membrane, creating pores. A second consequence of this electric field is the migration of the negatively charged DNA towards the positive electrode. As a result, only cells on the side of the injection site closer to the positive electrode become transfected with the DNA.

Now that you know the basic principles, let’s talk about how to prepare embryos for electroporation. If you need to use embryos older than Hamburger Hamilton stage 20, it’s best to culture your chicks outside of the shell, or ex ovo, for improved tissue access. This video will focus on electroporations performed on early embryos developing within the shell, or in ovo.

To begin, eggs should be incubated in a humidified incubator at 37 °C until they have reached the desired developmental stage. While the eggs are incubating, prepare the tools for injection and electroporation. First, make capillary needles by pulling a 0.5 mm glass pipet with a pipet puller. To open the pipet, place it under a microscope and break off a small piece of the tip. Then, prepare the injection solution, which should contain an appropriate dilution of your construct as well as a dye to help you visualize the injected solution.

To control the movement of fluid within the needle, attach it to a human-powered mouth pipet. Alternatively, the needle can be loaded onto a microinjector, which provides adjustable pressure pulses of air. Fill the needle by submerging the tip in the injection solution and applying negative pressure.

In addition to needles, you’ll also need electrodes. These consist of two exposed wires fixed together by an adaptor. A pair of cables connects the electrodes to the electric pulse generator, or electroporator, which controls the pulse duration, frequency, and voltage. For hands free operation, the electroporator can be activated by a foot pedal.

Once the eggs are ready, cut a window in the shell, and add a few drops of physiological salt solution, such as Hanks, to prevent the embryo from drying out. Under a microscope, position the egg such that the tissue of interest is accessible to the needle. Then, pierce the embryo with the capillary needle and deliver the solution by applying gentle pressure.

Now that we’ve injected the construct, it’s time to perform the electroporation. Position the electrodes so that they are submerged in the Hank’s solution and the tissue of interest is centered between them. In order to apply the electrical current, press the foot pedal and look for bubbles forming around the electrodes.

Once the electroporation is complete, remove the electrodes from the embryo and wipe them down with 70% ethanol. Add a few drops of salt solution supplemented with antibiotics to prevent infection, and seal the window with tape. Finally, place the eggs back in the incubator for continued development prior to phenotypic analysis.

Now that we’ve learned all about in ovo electroporation, let’s look at some examples of how scientists are applying this technique in developmental research.

To begin, electroporation can be used to block gene expression by delivery of knockdown constructs. In this example, cells of the developing neural tube were electroporated with gene silencing constructs. The embryos were allowed to develop, and then axon trajectories were compared between normal and knockdown samples to assess the genetic control of axon guidance.

On the flipside, in ovo electroporation can also be used to express a protein in a subset of cells by introducing a plasmid containing a protein-encoding gene and a promoter: a sequence which binds RNA polymerase to initiate transcription. Here, scientists delivered a single gene into cells of the embryonic brain. Tissue staining to detect both the protein product of this gene and markers of specific neural subtypes shows that the electroporated gene alters neural development.

DNA constructs encoding fluorescent proteins can also be introduced by electroporation to visualize cells and structures during development. This allows for live imaging of complex processes, such as spinal cord development, giving insight into the dynamics of cell movements over time.

You’ve just watched JoVE’s introduction to in ovo electroporation, a useful technique for delivering genetic material into chicks. This video discussed the basic principles of electroporation, steps required to inject and electroporate chicks, and applications of this technique in current developmental research. Thanks for watching!

Tags

Valor vacío tema