Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testis y individuales masculinos quistes línea germinal: Disección, Imaging y Tratamiento farmacológico

El objetivo general de este procedimiento es preparar cultivos ex vivo de drosophila, testículos de la pupila y quistes de la línea germinal para realizar estudios de imagen en vivo y tratamientos con inhibidores para analizar la miogénesis postmiótica. Para la miogénesis, esto se logra diseccionando primero los testículos intactos desde el puy temprano 24 horas después de la formación de purio. El segundo paso es diseccionar quistes de línea germinal individuales de estos testículos, luego los testículos intactos y los quistes de línea germinal individuales se pueden usar para experimentos de imágenes en vivo. Alternativamente, el siguiente paso es incubar los testículos intactos o el quiste de la línea germinal con compuestos inhibidores.

En última instancia, la tinción inmunológica de calabaza, los testículos y la microscopía de fluorescencia se utilizan para controlar el efecto del tratamiento. La principal ventaja de esta técnica de cultivo ex vivo sobre los métodos genéticos existentes es que permite acceder a la espermatogénesis dilo durante las etapas postmióticas. En general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque algunas experiencias necesitaron diseccionar y manipular los tejidos de la pupila.

Para comenzar el experimento, distribuya gotas de 80 microlitros de escudos y medio de insectos San M tres con suero fetal bovino y antibióticos en una placa de Petri de 10 centímetros. A continuación, con un par de pinzas anchas, elija una pupa y transfiérala a una gota de medio en el plato. A continuación, transfiera los materiales a un microscopio estereoscópico equipado con un iluminador de fibra óptica.

Tenga cuidado de no calentar los testículos por encima de la temperatura ambiente durante la disección con pinzas número cinco. Agarra la pupa por su extremo más posterior y mantenla en posición. Agarra las esféricas anteriores con otro par de pinzas y abre la pupila una permanente en su extremo anterior.

Despegue la caja de la pupila hasta que al menos parte del tórax quede expuesta. Continúa sosteniendo la pupa en su posición por su extremo más posterior y libera la presión interna de la pupa insertando ambos brazos de un par de pinzas en la región de la cabeza de la pupa. A continuación, abra la pupa abriendo las pinzas y moviendo las pinzas en la dirección anterior y asegúrese de que la abertura sea lo más grande posible en el primer intento.

Evite dañar la pupa en su extremo posterior antes de que se haya liberado la presión. Ya que esto podría resultar en que los testículos sean empujados directamente a través de la pequeña abertura y se dañen. Una vez que se abre la pupa, la presión interna liberada de la pupa expulsa el glomerado de células grasas del cuerpo y tejido a través de la gran abertura.

A continuación, aumente el tamaño de la abertura con un par de pinzas y evite apretar la pupa con las pinzas, ya que esto podría dañar los testículos. A continuación, sostenga la pupa en su extremo más posterior cerca. El otro par de pinzas y raya suavemente el contenido de la pupa de posterior a anterior para liberar los testículos de la pupa.

Compruebe si los testículos de la pupila han sido expulsados. No se conectarán a ningún otro tejido. A las 24 horas, un PF recoge los testículos con una punta de pipeta precortada de 200 microlitros.

Transfiera solo una pequeña cantidad del medio para reducir la cantidad de células grasas corporales que transportan los testículos. A continuación, coloque los testículos en medio en una placa de cultivo fresca. Lave los testículos varias veces con medio hasta que solo queden unas pocas células corporales grasas para obtener imágenes vivas.

Transfiera los testículos a una placa de cultivo con fondo de vidrio con medio y use un microscopio de imágenes invertido para comenzar la disección. Transfiera uno o más testículos de la pupila a una placa de cultivo con fondo de vidrio llena de medio. Utilice un microscopio estereoscópico con iluminación de fibra óptica y dos agujas de acero inoxidable para la disección de quistes de la línea germinal masculina.

Con una aguja cuidadosamente sujetada, un testículo en su extremo anterior o posterior y manténgalo en posición. Inserte la otra aguja en el testículo y rompa la vaina del testículo moviendo la aguja hacia los lados, lo que liberará muchos de los quistes. Continúe sosteniendo un testículo en posición con una aguja.

Luego, use la otra aguja para extirpar suavemente los quistes restantes del testículo. A continuación, separar los quistes agregados. Utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros transfiriendo los quistes a una placa cultivada fresca con medio.

A continuación, mueva la placa cultivada a un microscopio de imágenes invertidas para obtener imágenes en vivo de quistes individuales. Disperse los quistes nuevamente con una aguja si es necesario, identifique el estadio de los quistes mediante el uso de contraste de fase y microscopía de fluorescencia. Concéntrese en un quiste de la etapa deseada.

Confirme el enfoque y la posición del quiste con frecuencia. Durante los experimentos de imagen más largos, los quistes no se adhieren al fondo de la placa de cultivo. Intenta flotar fuera de foco.

Llene cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos con 500 microlitros de medio para un experimento de 12 réplicas. A continuación, transfiera un testículo de la pupila a cada pocillo utilizando una punta de pipeta precortada de 200 microlitros. A continuación, compruebe la presencia de protamina en los testículos aislados utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.

Los testículos deben estar libres de protamina, señal B-E-G-F-P, que indica que no se ha producido el cambio de hisona a protamina o HP en ninguno de los quistes. Reemplace los testículos que ya muestran quistes positivos. Agregue 500 microlitros de medio que contenga ácido endocarídico, el compuesto inhibidor para alcanzar una concentración final de 150 micromolares en un mililitro a cada uno de los primeros 12 pocillos.

Utilice los pocillos restantes como controles no tratados agregando 500 microlitros de medio con solvente. Luego incube la placa a cinco grados centígrados durante 24 horas en la oscuridad. Compruebe de nuevo la presencia de protamina en los testículos incubados.

Los testículos de control ahora deben mostrar uno o más quistes positivos para protamina, B-E-G-F-P, lo que indica una transición a través del interruptor HP. A continuación, utilizando una pipeta con una punta de 200 microlitros, transfiera los testículos a portaobjetos recubiertos de lisina poliL. Realizar preparaciones de calabaza y tinción con anticuerpos fluorescentes.

Siguiendo los protocolos publicados, se obtuvieron imágenes de contraste de fase de los testículos de Drosophila utilizando este método de disección. Se trata de un testículo de montura entera ligeramente aplastado de una pupa de Drosophila. A las 24 horas después de la formación de PY o de una PF, las espermatogonias se restringen a la punta anterior por debajo de la región del centro.

El testículo restante está lleno de espermatocitos, espermátidas en la etapa actual de Nevin con núcleos redondos y espermátidas en etapas alargadas con superposiciones de flagelos crecientes de contraste de fase, se obtuvieron imágenes fluorescentes EGFP y RFP de testículos pupilales montados en el hogar para detectar H, dos A-V-D-R-F-P y protamina B-E-G-F-P a las 24 horas A PF. Ninguna de las espermátidas se ha sometido al cambio HP con frecuencia. Los testículos diseccionados en esta etapa contienen una estructura de autofluorescencia. Un testículo de la pupila disecado a las 36 horas Un PF muestra el primer quiste positivo para protamina, B-E-G-F-P.

Los testículos de la pupila 48 horas A PF tienen varios quistes de la línea germinal con núcleos visibles positivos para protamina. Se pueden grabar imágenes en vivo ex vivo de testículos enteros que se desarrollan en cultivo. Con este método, se diseccionó un testículo de la pupila durante 45 horas, se incubó un PF en medio durante seis horas y se obtuvieron imágenes cada cinco minutos.

Dentro de este período de tiempo, varios quistes de espermátidas emergen de la etapa de cambio HP y muestran una señal brillante de protamina B-E-G-F-P. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener testículo de la primera pupila y quiste de línea germinal única en cultivo para realizar tratamientos de imágenes o inhibidores in vivo.