Name: Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Aprende a medir flujos unidireccionales de potasio y amoníaco en plántulas de cebada intactas usando trazadores radiactivos. Este método caracteriza sistemas de transporte de nutrientes en membranas vegetales.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), el programa de la Cátedra de Investigación de Canadá (CRC) y la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI).

<html> 1. Planta cultura y Preparación <ol><li> Crezca las plantas de semillero de cebada hidropónico durante 7 días en una cámara de crecimiento con temperatura controlada (para más detalles, véase 10). NOTA: Es importante tener en cuenta el examen de plantas en diversas etapas de desarrollo, como las necesidades de nutrientes van a cambiar con la edad. </li><li> Un día antes de la experimentación, agrupar varias plantas juntas para hacer una sola réplica (3 plantas por paquete para DI, 6 plantas por paquete para CATE). Plántulas Bundle por envolver un trozo de 2 cm de tubo Tygon alrededor de la parte basal de los brotes, y asegurar el tubo con cinta adhesiva para crear un &quot;collar&quot;. NOTA: El número de plantas por paquete puede variar según las condiciones experimentales 10,13,14. La agrupación se realiza para mejorar las estadísticas y la precisión de la medición, sobre todo cuando la masa de raíces y / o actividad específica son bajos. </li></ol> 2 Preparación de Soluciones Experimental / Materiales contenido &quot;&gt; NOTA: La siguiente se realiza típicamente 1 día antes de la experimentación. <ol><li> Por DI, reunir los siguientes: Pre-etiquetado, etiquetado y soluciones de desorción (para más detalles, véase 11), tubos de centrifugación (por centrifugado de las muestras de las plantas), y los viales de muestra (por material vegetal y la actividad específica [S o; vea abajo]). Airear y mezclar todas las soluciones. </li><li> Para CATE, reunir los siguientes: soluciones, etiquetado aireado bien mezclado y elución (para más detalles, véase 10), embudos, tubos de centrifugación de flujo de salida (por centrifugado de las muestras de plantas), y los viales de muestra (por eluidos, muestras de plantas, y determinación de S O y factor de dilución [D f, véase más adelante]). </li></ol> 3. Preparar radiotrazadores ATENCIÓN: Las siguientes medidas de seguridad se deben tomar antes de trabajar con la radiactividad. <ol><li> Asegúrese de que los requisitos de la radioactiva licencia materiales se entienden y lo siguió. Utilice el equipo de seguridad adecuado (es decir, gafas, guantes, bata de laboratorio, plomo chaleco / cuello) y dosímetros (por ejemplo, un anillo de TLD y placa). Configure blindaje (es decir, plexiglás y ladrillos de plomo) y realizar el trabajo radiactiva detrás de él. Asegúrese de que un contador Geiger-Müller está presente con el fin de monitorear rutinariamente para la contaminación. </li><li> Preparación de 42 K + <ol><li> Coloque un vaso de precipitados limpio y seco en el equilibrio. Cero la balanza. </li><li> Eliminar vial de trazador (20 mCi de 42 K 2 CO 3, en forma de polvo) de los envases y verter trazador en el vaso de precipitados. Tome nota de la masa. </li><li> Pipeta 19,93 ml de dH 2 O, seguido de 0,07 ml de H 2 SO 4, en el vaso de precipitados. Esto conducirá a la siguiente reacción química: 42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H2O (l) → 42 </sarriba&gt; K 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) </li><li> Calcular la concentración de la solución madre radiactivo, dada la masa y el peso molecular de K 2 CO 3, y el volumen (20 ml). NOTA: Si se trabaja con 13 NH 3/13 NH 4 + El marcador se produjo en un ciclotrón mediante el bombardeo de protones del átomo de oxígeno del agua (por lo general resulta en la actividad 100-200 mCi; para los detalles de producción, ver 12). Debido a que la cantidad de NH 14 3/14 NH 4 + es extremadamente baja en estas soluciones, la concentración de N de la solución madre es insignificante. </li></ol></li></ol> 4. afluencia directa (DI) Medición <ol><li> Para 42 K +, pipetear la cantidad de solución de stock radiactivo requerida para alcanzar la concentración final deseada de K + en la solución de etiquetado. <ol><li> Para NH 13 3/13 NH 4 +, pipeta una pequeña cantidad (&lt;0,5 ml) en la solución de etiquetado. Deje que la solución de etiquetado para mezclar bien (a través de la aireación). </li></ol></li><li> Pipetear una sub-muestra de 1 ml de solución de etiquetado en un vial de la muestra y repetir tres veces (4 muestras en total). <ol><li> Medir la radiactividad en viales (en &quot;cuentas por minuto, cpm)&quot;, usando un contador gamma. Asegúrese de que el contador está programado de tal modo que las lecturas de CPM se corrigieron para la desintegración isotópica (esto es particularmente importante para tales trazadores de corta duración). </li><li> Calcular S o (expresada como cpm -1 mol) por el promedio de los recuentos de las cuatro muestras (cpm ml -1) y dividiendo por la concentración de sustrato en solución (mol ml -1). </li></ol></li><li> Sumergir raíces en solución de pre-etiquetado (no radiactivo) durante 5 min, para pre-equilibrar las plantas bajo condiciones de prueba (véasepor ejemplo, 10,13,14 para variaciones en el tiempo de pre-label). </li><li> Sumergir las raíces en el etiquetado de solución (radiactivo) durante 5 min. NOTA: Los tiempos de etiquetado pueden variar en función del experimento 3,4,7-10. </li><li> Transferencia raíces a la solución de desorción durante 5 segundos para eliminar la mayor parte de la radiactividad-adhesión superficie. Transferencia raíces en un segundo vaso de precipitados de la solución de desorción durante 5 min a las raíces más claras de trazador extracelular. </li><li> Diseccionar y brotes separados, brotes basales y raíces. </li><li> Coloque raíces en tubos de centrifugación y las muestras de centrifugado durante 30 segundos en una baja velocidad, centrífuga clínica-grado (~ 5.000 xg) para eliminar de la superficie y el agua intersticial. </li><li> Pesar raíces (peso fresco, FW). </li><li> Contar la radiactividad en muestras vegetales (brotes, brotes basales, y la raíz; vea el paso 4.2.1). </li><li> Calcular el flujo. Calcular afluencia en la planta usando la fórmula Φ = Q * / S o en peso de L donde Φ es el flujo(Mol -1 h -1 g), Q * es la cantidad de trazador acumulada en el tejido (cpm, por lo general en la raíz, disparar y disparar basal, combinado), S o es la actividad específica de la solución de etiquetado (mol cpm - 1), w es el peso fresco de la raíz (g), y L t es el tiempo de etiquetado (hr). NOTA: cálculo más sofisticado se puede hacer para dar cuenta de flujo de salida de trazador simultánea de las raíces durante el etiquetado y desorción, en base a los parámetros obtenidos de CATE (véase más adelante; para más detalles, ver 4). </li></ol> 5. compartimental Análisis Tracer Eflujo (CATE) Medición <ol><li> Prepare la solución de etiquetado y medida S o (consulte los pasos 4.1 a 4.2, más arriba). </li><li> Mida factor de dilución (D f). NOTA: A menudo, la posición de la muestra en relación con el detector en el contador gamma puede influir en la cantidadde radiación medida. Véase la discusión para más detalles. <ol><li> Después de medir o S, añadir 19 ml de H 2 O a cada muestra (de manera que el volumen final = volumen eluido = 20 ml). Conteo de radiactividad en cada muestra de 20 ml (ver paso 4.2.1). </li><li> Calcular D f dividiendo el cpm promedio de las muestras de 1 ml por la cpm media de las muestras de 20 ml. </li></ol></li><li> Sumerja sus raíces en la solución de etiquetado durante 1 hora. </li><li> Retire las plantas de las plantas de soluciones de etiquetado y de transferencia efluir embudo, asegurando todo el material de la raíz está dentro del embudo. Gently plantas seguras al lado del embudo de flujo de salida mediante la aplicación de una pequeña tira de cinta adhesiva sobre el anillo de plástico. </li><li> Vierta suavemente el primer eluato en el embudo. Iniciar temporizador (contando). </li><li> Abra el grifo y recoger el eluido en el vial de la muestra después de 15 segundos (nota: tiempo de elución variará, véase más adelante). Cierre el grifo. Vierta suavemente la próxima eluato en el embudo. </li><li> REPEAt paso 5.6 para el resto de la serie de elución, que sigue, desde el primero al eluato final: 15 seg (cuatro veces), 20 seg (tres veces), 30 seg (dos veces), 40 seg (una vez), 50 sec (una vez), 1 min (25 veces), durante un período de elución total de 29,5 min NOTA: Serie de desorción puede variar según las condiciones experimentales 7-10,13,14. </li><li> Una vez que el protocolo de elución es completa, las plantas de cosecha (pasos 4.6 a 4.8, más arriba). </li><li> Contar la radiactividad en los eluidos y muestras de plantas en el contador gamma (multiplicando la lectura para cada eluato por D f, ver 5.2). </li><li> Parcela liberación trazador (cpm g (FW raíz) -1 min -1) como una función de tiempo de elución. Para condiciones de estado estacionario, realizar regresiones lineales y los cálculos de los flujos, la vida media de intercambio y tamaños de piscina (para más detalles, consulte 6-9). </li></ol>

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<li>Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+depolarization+induces+K%2B+efflux+from+subapical+maize+root+segments%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments.</a> New Phytol. 154, 45-51 (2002).</li>
<li>Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+uptake+by+rice+roots.+3.+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology.</a> Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).</li>
<li>Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+homeostasis+in+vacuolate+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Potassium homeostasis in vacuolate plant cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).</li>
<li>Holm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NH3+and+NH4%2B+permeability+in+aquaporin-expressing+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes.</a> Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).</li>
<li>Britto, D. T., Kronzucker, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-stimulation+of+13NH4%2B+efflux+provides+evidence+for+the+cytosolic+origin+of+tracer+in+the+compartmental+analysis+of+barley+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Funct.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots.</a> Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).</li>
<li>Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Futile+Na%2B+cycling+at+the+root+plasma+membrane+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%3A+kinetics%2C+energetics%2C+and+relationship+to+salinity+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance.</a> J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).</li>
<li>Kronzucker, H. J., Britto, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+transport+in+plants%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sodium transport in plants: a critical review.</a> New Phytol. 189, 54-81 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como se demuestra en los ejemplos anteriores, el método radiotrazador es un poderoso medio de la medición de los flujos unidireccionales de nutrientes y sustancias tóxicas en planta. Figura 1 muestra que NH 3 afluencia puede llegar a más de 225 mmol g -1 h -1, que es tal vez el más alto bona fide transmembrana flujo siempre informó en un sistema planta 13, pero la magnitud de este flujo no sería visible si sólo se midieron los flujos netos. E...

La absorción y distribución de los nutrientes y las sustancias tóxicas influyen fuertemente en el crecimiento vegetal. En consecuencia, la investigación de los procesos de transporte subyacentes constituye un área importante de la investigación en biología de las plantas y de las ciencias agrícolas 1,2, especialmente en el contexto de la optimización nutricional y el estrés ambiental (por ejemplo, estrés por salinidad, toxicidad de amonio). El principal de los métodos para la medición de los flujos en las plantas es el uso de trazadores radioisotópicos, que fue desarrollado significativamente en los años 1950 (véase, por ejemplo, 3) y sigue siendo ampliamente utilizado hoy. Otros métodos, como la medición de agotamiento de los nutrientes del medio de la raíz y / o la acumulación en los tejidos, el uso de microelectrodos vibrantes ion-selectivos tales como MIFE (microelectrodos ión estimación de flujo) y SIET (escanear técnica electrodo selectivo de iones), y el uso de colorantes fluorescentes selectivos de iones, también se aplican ampliamente, pero están limitados en su capacidad para detectar la gripe netaxes (es decir, la diferencia entre la afluencia y de flujo de salida). El uso de radioisótopos, por otro lado, permite al investigador la capacidad única de aislar y cuantificar los flujos unidireccionales, que se puede utilizar para resolver los parámetros cinéticos (por ejemplo, K M y V max), y proporcionar una idea de la capacidad, energética, mecanismos y regulación, de los sistemas de transporte. Las mediciones de flujo unidireccionales hechas con radiotrazadores son particularmente útiles en condiciones donde el flujo en la dirección opuesta es alta, y el volumen de piscinas intracelular es rápida 4. Por otra parte, los métodos de radiotrazadores permiten mediciones que se llevan a cabo bajo concentraciones bastante altas de sustrato, a diferencia de muchas otras técnicas (ver &quot;Discusión&quot;, más abajo), ya que el isótopo trazado se observa contra un fondo de otro isótopo del mismo elemento. Aquí, ofrecemos los pasos detallados para la medición radioisotópica de unidireccional y net flujos de nutrientes minerales y las sustancias tóxicas en plantas intactas. Se hará énfasis en la medición de flujo de potasio (K +), un macronutriente planta 5, y amoniaco / amonio (NH 3 / NH 4 +), otro de macronutrientes que es, sin embargo, tóxico cuando está presente en altas concentraciones (por ejemplo, de 1 10 mM) 2. Usaremos los radioisótopos 42 K + (t 1/2 = 12.36 h) y 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respectivamente, en las plántulas intactas de la cebada sistema modelo (Hordeum vulgare L .), en la descripción de los dos protocolos clave: afluencia directa (DI) y el análisis compartimental por flujo de salida de trazador (CATE). Debemos tener en cuenta desde el principio que este artículo sólo se describen los pasos necesarios para llevar a cabo cada protocolo. En su caso, se proporcionan breves explicaciones de los cálculos y la teoría, pero detalladas exposiciones de cada técnica&#39;S fondo y la teoría se pueden encontrar en varios artículos sobre el tema clave 4,6-9. Es importante destacar que estos protocolos son ampliamente transferibles al flujo análisis de otros nutrientes / sustancias tóxicas (por ejemplo, 24 Na +, 22 Na +, Rb + 86, 13 NO 3 -) y para otras especies de plantas, aunque con algunas salvedades (véase más adelante) . También hacemos hincapié en la importancia de que todos los investigadores que trabajan con materiales radiactivos deben trabajar bajo una licencia organizado a través ionizante regulador de la seguridad radiológica de su institución.

<table><tbody><tr><td>Contador gamma</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Modelo: Wallac 1480 Wizard 3"</td></tr><tr><td>Geiger-M&uuml; ller counter</td><td>Ludlum Measurements Inc.</td><td></td><td>Medidor topográfico modelo 3</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de vidrio de 400 ml</td><td>VWR</td><td>89000-206</td><td>Para soluciones de preabsorción, absorción y desorción</td></tr><tr><td>Embudo de vidrio</td><td>VWR</td><td>89000-466</td><td>Para embudo de eflujo</td></tr><tr><td>Tubo grande</td><td>VWR</td><td>529297</td><td>Para embudo de eflujo</td></tr><tr><td>Tubo mediano</td><td>VWR</td><td>684783</td><td>Para agrupar</td></tr><tr><td>Tubos pequeños</td><td>VWR</td><td>63013-541</td><td>Para aireación</td></tr><tr><td>Colector de aireación</td><td>Penn Plax Air Tech</td><td>vat 5.5</td><td>Para controlar/distribuir aire presurizado en soluciones</td></tr><tr><td>Viales de centelleo de vidrio</td><td>VWR</td><td>66022-128</td><td>Para el recuento de rayos gamma</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de vidrio</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>Para muestras de raíces de centrifugación</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>470173-504</td><td>Para muestras de raíces de centrifugación</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>VWR</td><td>470001-828</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>VWR</td><td>470005-496</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga clínica de baja velocidad</td><td>International Equipment Co.</td><td>76466M-4</td><td>Para el centrifugado de muestras de raíces</td></tr><tr><td>Pipeta de 1 ml</td><td>Gilson</td><td>F144493</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 10 ml</td><td>Gilson</td><td>F144494</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 1 ml</td><td>VWR</td><td>89079-470</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 10 ml</td><td>VWR</td><td>89087-532</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Mettler toledo</td><td>PB403-S/FACT</td><td></td></tr></tbody></table>

flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con trazadores radiactivos

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

La afluencia y efluencia unidireccional de nutrientes y tóxicos, y sus flujos netos resultantes, son fundamentales para la nutrición y toxicología de las plantas. El rastreo de radioisótopos es una técnica importante utilizada para medir dichos flujos, tanto dentro de las plantas como entre las plantas y sus entornos. Los datos de flujo obtenidos con protocolos de radiotrazadores pueden ayudar a dilucidar la capacidad, el mecanismo, la regulación y la energía de los sistemas de transporte de nutrientes minerales o tóxicos específicos, y pueden proporcionar información sobre las tasas de compartimentación y renovación de los grupos de minerales y metabolitos subcelulares. Aquí, describimos dos protocolos principales de radioisótopos utilizados en biología vegetal: afluencia directa (DI) y análisis compartimental por eflujo de trazadores (CATE). Nos centramos en la medición del flujo de potasio (K+) como nutriente, y amoníaco/amonio (NH3/NH4+) como tóxico, en plántulas intactas de la especie modelo cebada (Hordeum vulgare L.). Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente a otros sistemas experimentales (por ejemplo, diferentes especies, material vegetal extirpado y otros nutrientes/tóxicos). Se discuten las ventajas y limitaciones de estos protocolos.

La Figura 1 muestra isotermas encontrados utilizando la técnica de DI (con 13 N), para la afluencia de NH 3 en las raíces de las plántulas de cebada cultivadas intactas a alta (10 mM) NH 4 +, y, o bien bajo (0,02 mM) o alta (5 mM ) K +. Las isotermas muestran la cinética de Michaelis-Menten cuando los flujos de NH 3 se representan gráficamente como una función de la concentración externa NH 3 ([NH 3] ext; ajustado po...

La medición de los flujos de nutrientes y tóxicos en planta es esencial para el estudio de la nutrición y toxicidad de las plantas. Aquí, cubrimos los protocolos de radiotrazadores para la determinación de la afluencia y el eflujo en raíces de plantas intactas, utilizando flujos de potasio (K+) y amoníaco/amonio (NH3/NH4+) como ejemplos. Se discuten las ventajas y limitaciones de tales técnicas.

Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir los flujos unidireccionales de potasio y amoníaco dentro y fuera de las raíces de las plántulas de cebada intactas, y caracterizar el funcionamiento de los sistemas de transporte de nutrientes clave en las membranas de las plantas. Esto se logra cultivando primero las plántulas durante una semana en soluciones hidropónicas de composición química específica para garantizar que las plantas estén en un estado nutricional estable. El cultivo hidropónico permite que las raíces sean accesibles para la manipulación experimental.Como segundo paso, las raíces de las plantas intactas se sumergen durante períodos variables de tiempo en soluciones experimentales, incluidas las soluciones de absorción, que tienen el sustrato de interés enriquecido con su isótopo radiactivo. Este paso se utilizará para determinar las tasas de transporte dentro y fuera de las plántulas. A continuación, las plantas se diseccionan inmediatamente después de un breve período de absorción para experimentos de afluencia unidireccional o se transfieren a un embudo FLX después de una absorción más larga para medir la liberación de trazadores.Mediante el análisis compartimentado por trazador, flx o Kate, se obtienen resultados que pueden revelar aspectos clave de la capacidad, la energía, los mecanismos y la regulación de los sistemas de transporte. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la fisiología nutricional de las plantas, como por ejemplo, ¿cómo se transportan los nutrientes minerales y los tóxicos dentro y fuera de las plantas? ¿Cómo responden estos flujos a los entornos cambiantes y cómo afectan a la compartimentación del sustrato, las células y los tejidos?Y, por último, ¿cómo afectan los estreses abióticos que comprometen los entornos ecológicos en la agricultura, como la salinidad, la sequía y la toxicidad por metales pesados, los flujos y la dinámica de los nutrientes de las plantas? La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ensayos de agotamiento o acumulación de sustrato, o las mediciones de electrodos vibratorios selectivos de hierro, es que podemos medir flujos unidireccionales en lugar de flexiones netas, que es una diferencia entre influjo y eFlex. De este modo, podemos obtener información valiosa sobre la capacidad energética, los mecanismos y la regulación de los sistemas de transporte de nutrientes e intoxicantes de las plantas.La especie modelo cebada se utilizará en este experimento, cultive las plántulas de cebada hidropónicamente durante siete días en una cámara de crecimiento con clima controlado un día antes de la experimentación, agrupe varias plántulas para hacer una sola réplica. Envuelva un trozo de tubo de tigón de dos centímetros alrededor de la parte basal de los conductos y asegure el tubo con cinta adhesiva para crear un collar. Utilice tres plantas por haz para el ensayo de afluencia directa o DI y seis plantas por paquete para el análisis compartimental mediante ensayo trazador, flx o Kate un día antes del experimento.Prepare los siguientes materiales y soluciones para DI, reúna soluciones de preetiquetado, etiquetado y desorción, tubos de centrifugación y viales de muestra, airee y mezcle todas las soluciones para Kate. Reúna el siguiente pozo. Soluciones mixtas de marcaje y elución aireadas, embudos de eflujo, tubos de centrifugación y viales de muestra.Preparar los radiotrazadores el día del experimento siguiendo todos los requisitos de la licencia de materiales radiactivos de la institución. Use el equipo de seguridad y los dosímetros adecuados y use un blindaje adecuado para la preparación del isótopo radiactivo de potasio. Potasio 42.Coloque un vaso de precipitados limpio y seco en la balanza y ponga a cero la balanza. Saca un vial del trazador de su embalaje y vierte el polvo en el vaso de precipitados. Tome nota de la pipeta de masa, 19,93 mililitros de agua destilada en el vaso de precipitados, seguidos de 0,07 mililitros de ácido sulfúrico.Posteriormente, se calcula la concentración de la solución madre radiactiva. Dada la masa y el peso molecular del carbonato de potasio y el volumen de la solución, use un contador Geiger Mueller para monitorear rutinariamente la contaminación. El isótopo radiactivo del nitrógeno 13 se produce en un ciclotrón y llega como líquido para las mediciones de DI.Uso de pipeta de potasio 42: la cantidad de solución madre radiactiva necesaria para alcanzar la concentración final deseada de potasio en la solución de etiquetado: Para las mediciones de DI con pipetea con nitrógeno 13, una pequeña cantidad inferior a 0,5 mililitros del radiotrazador en la solución de etiquetado. Deje que la solución de etiquetado se mezcle completamente mediante aireación. A continuación, pipetee una submuestra de un mililitro de solución de etiquetado en cada uno de los cuatro viales de muestra.Mida la actividad de radio en los viales usando un contador gamma. Asegúrese de que el contador esté programado de manera que se corrijan los recuentos por minuto o las lecturas de CPM. Para la desintegración isotópica, que es particularmente importante para los trazadores de vida corta, calcule la actividad específica de la solución de etiquetado S no expresada como recuentos por minuto por micromol promediando los recuentos de las cuatro muestras y dividiendo por la concentración de sustrato en solución, sumerja las raíces de cebada en una solución de preetiquetado no radiactiva durante cinco minutos para preequilibrar las plantas en condiciones de prueba.Después de eso, sumerja las raíces en la solución de marcaje radiactivo durante cinco minutos. Transfiera las raíces a una solución de desorción durante cinco segundos para eliminar la mayor parte de la actividad de radio adherida a la superficie. A continuación, transfiera las raíces a un segundo vaso de precipitados con solución de desorción durante cinco minutos.Para limpiar aún más las raíces del trazador extracelular, diseccione y separe los brotes, los brotes basales y las raíces. Coloque las raíces en tubos de centrífuga y centrifuga las muestras durante 30 segundos en una centrífuga de grado clínico de baja velocidad. Para eliminar el agua superficial e intersticial, pese las raíces para obtener el peso fresco.Mida la radiactividad en las muestras de la planta usando un contador gamma, calcule el flujo de entrada a la planta usando esta fórmula. Comience este procedimiento preparando la solución de etiquetado y midiendo el nudo S como se muestra anteriormente. Después de medir, agregue 19 mililitros de agua a cada muestra de modo que el volumen final sea igual al volumen EIT de 20 mililitros.Cuente la actividad de radio en cada muestra de 20 mililitros. Sumerja las raíces en la solución de etiquetado durante una hora. Después de una hora, retire las plantas de la solución de etiquetado y transfiéralas al embudo FLX, asegurándose de que todo el material de las raíces esté dentro del embudo.Asegure suavemente las plantas al costado del embudo de eflujo aplicando una pequeña tira de cinta adhesiva sobre el collar de plástico Vierta suavemente el primer elu en el embudo. Inicie un temporizador para contar en segundos y, después de 15 segundos, abra el grifo y recoja el EIT en el vial de muestra. Cierre la espita y vierta suavemente el siguiente EIT en el embudo.De esta manera, recoja el EIT para el resto de la serie Elucian durante un período total de la UE de 29,5 minutos. Una vez que se complete el protocolo de la UE, se cosecharán las plantas como se mostró anteriormente, se contará la actividad de radio en los EIT y las muestras de plantas utilizando el contador gamma, multiplicando la lectura de cada EIT por el factor de dilución que grafique la liberación del trazador en función del tiempo de elución para condiciones de estado estacionario, realizar regresiones lineales y cálculos de flujos. Medias mentiras de cambio y tamaños de piscina.Aquí se muestran isotermas representativas de la afluencia de amoníaco en función de las diferentes concentraciones externas de amoníaco. En las raíces intactas de las plántulas de cebada cultivadas con alto contenido de amoníaco o amonio, y los flujos de amoníaco con bajo o alto contenido de potasio fueron significativamente más altos con bajo contenido de potasio. Los análisis de Menin de las isotermas revelan que el potasio alto tiene relativamente poco efecto sobre la afinidad del sustrato de los transportadores de absorción de amoníaco, pero reduce significativamente la capacidad de transporte.El siguiente resultado pone de manifiesto la rápida plasticidad del sistema de absorción de potasio. En raíces de plántulas de cebada intactas cultivadas con moderado potasio y alto contenido de amonio. Se observó un aumento de casi el 350% en la afluencia de potasio a los cinco minutos de la retirada de amonio de la solución externa.Este efecto de extracción de amonio fue sensible a los bloqueadores de los canales de potasio, el tetraetilo amonio bario, un cesio. Estos gráficos muestran el potasio 42 efl en estado estacionario en raíces de plántulas de cebada intactas cultivadas con bajo contenido de potasio y nitrato moderado, y los efectos inmediatos de cloruro de cesio 10 milimolar, sulfato de potasio cinco milimolares y sulfato de amonio cinco milimolares en FLX El potasio FLX fue inhibido por cesio o potasio, pero estimulado por amonio. Cate también se puede utilizar para estimar las concentraciones y los tiempos de renovación del sustrato en los compartimentos subcelulares.El análisis de regresión de la fase de intercambio lento de la liberación de trazadores junto con la retención de trazadores en los tejidos vegetales puede revelar información importante sobre el tamaño del grupo y las vidas medias de intercambio de componentes subcelulares como la pared celular, el citoplasma y el VA. Esta tabla muestra los parámetros del cabo extraídos de las mediciones de potasio en estado estacionario 42 flx en plántulas de cebada cultivadas con un milimolar de nitrato o 10 milimolar de amonio. Esto último representando un escenario tóxico.El alto contenido de amonio provoca la supresión de todos los fundentes de potasio y una disminución significativa en el tamaño de la piscina. Una vez dominada, la eficiencia de la metodología DI se puede mejorar escalonando los tratamientos con 30 segundos de diferencia. Al hacerlo, podemos examinar hasta 10 condiciones en un solo experimento.Del mismo modo, se pueden realizar varias carreras de Kate simultáneamente si hay suficiente tiempo entre carreras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los flujos de nutrientes e intoxicantes en plantas intactas mediante el uso de trazadores radiactivos.

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