Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

La medición de los flujos de nutrientes y tóxicos en planta es esencial para el estudio de la nutrición y toxicidad de las plantas. Aquí, cubrimos los protocolos de radiotrazadores para la determinación de la afluencia y el eflujo en raíces de plantas intactas, utilizando flujos de potasio (K⁺) y amoníaco/amonio (NH₃/NH₄⁺) como ejemplos. Se discuten las ventajas y limitaciones de tales técnicas.

El objetivo general del siguiente experimento es medir los flujos unidireccionales de potasio y amoníaco dentro y fuera de las raíces de las plántulas de cebada intactas, y caracterizar el funcionamiento de los sistemas de transporte de nutrientes clave en las membranas de las plantas. Esto se logra cultivando primero las plántulas durante una semana en soluciones hidropónicas de composición química específica para garantizar que las plantas estén en un estado nutricional estable. El cultivo hidropónico permite que las raíces sean accesibles para la manipulación experimental.

Como segundo paso, las raíces de las plantas intactas se sumergen durante períodos variables de tiempo en soluciones experimentales, incluidas las soluciones de absorción, que tienen el sustrato de interés enriquecido con su isótopo radiactivo. Este paso se utilizará para determinar las tasas de transporte dentro y fuera de las plántulas. A continuación, las plantas se diseccionan inmediatamente después de un breve período de absorción para experimentos de afluencia unidireccional o se transfieren a un embudo FLX después de una absorción más larga para medir la liberación de trazadores.

Mediante el análisis compartimentado por trazador, flx o Kate, se obtienen resultados que pueden revelar aspectos clave de la capacidad, la energía, los mecanismos y la regulación de los sistemas de transporte. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la fisiología nutricional de las plantas, como por ejemplo, ¿cómo se transportan los nutrientes minerales y los tóxicos dentro y fuera de las plantas? ¿Cómo responden estos flujos a los entornos cambiantes y cómo afectan a la compartimentación del sustrato, las células y los tejidos?

Y, por último, ¿cómo afectan los estreses abióticos que comprometen los entornos ecológicos en la agricultura, como la salinidad, la sequía y la toxicidad por metales pesados, los flujos y la dinámica de los nutrientes de las plantas? La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ensayos de agotamiento o acumulación de sustrato, o las mediciones de electrodos vibratorios selectivos de hierro, es que podemos medir flujos unidireccionales en lugar de flexiones netas, que es una diferencia entre influjo y eFlex. De este modo, podemos obtener información valiosa sobre la capacidad energética, los mecanismos y la regulación de los sistemas de transporte de nutrientes e intoxicantes de las plantas.

La especie modelo cebada se utilizará en este experimento, cultive las plántulas de cebada hidropónicamente durante siete días en una cámara de crecimiento con clima controlado un día antes de la experimentación, agrupe varias plántulas para hacer una sola réplica. Envuelva un trozo de tubo de tigón de dos centímetros alrededor de la parte basal de los conductos y asegure el tubo con cinta adhesiva para crear un collar. Utilice tres plantas por haz para el ensayo de afluencia directa o DI y seis plantas por paquete para el análisis compartimental mediante ensayo trazador, flx o Kate un día antes del experimento.

Prepare los siguientes materiales y soluciones para DI, reúna soluciones de preetiquetado, etiquetado y desorción, tubos de centrifugación y viales de muestra, airee y mezcle todas las soluciones para Kate. Reúna el siguiente pozo. Soluciones mixtas de marcaje y elución aireadas, embudos de eflujo, tubos de centrifugación y viales de muestra.

Preparar los radiotrazadores el día del experimento siguiendo todos los requisitos de la licencia de materiales radiactivos de la institución. Use el equipo de seguridad y los dosímetros adecuados y use un blindaje adecuado para la preparación del isótopo radiactivo de potasio. Potasio 42.

Coloque un vaso de precipitados limpio y seco en la balanza y ponga a cero la balanza. Saca un vial del trazador de su embalaje y vierte el polvo en el vaso de precipitados. Tome nota de la pipeta de masa, 19,93 mililitros de agua destilada en el vaso de precipitados, seguidos de 0,07 mililitros de ácido sulfúrico.

Posteriormente, se calcula la concentración de la solución madre radiactiva. Dada la masa y el peso molecular del carbonato de potasio y el volumen de la solución, use un contador Geiger Mueller para monitorear rutinariamente la contaminación. El isótopo radiactivo del nitrógeno 13 se produce en un ciclotrón y llega como líquido para las mediciones de DI.

Uso de pipeta de potasio 42: la cantidad de solución madre radiactiva necesaria para alcanzar la concentración final deseada de potasio en la solución de etiquetado: Para las mediciones de DI con pipetea con nitrógeno 13, una pequeña cantidad inferior a 0,5 mililitros del radiotrazador en la solución de etiquetado. Deje que la solución de etiquetado se mezcle completamente mediante aireación. A continuación, pipetee una submuestra de un mililitro de solución de etiquetado en cada uno de los cuatro viales de muestra.

Mida la actividad de radio en los viales usando un contador gamma. Asegúrese de que el contador esté programado de manera que se corrijan los recuentos por minuto o las lecturas de CPM. Para la desintegración isotópica, que es particularmente importante para los trazadores de vida corta, calcule la actividad específica de la solución de etiquetado S no expresada como recuentos por minuto por micromol promediando los recuentos de las cuatro muestras y dividiendo por la concentración de sustrato en solución, sumerja las raíces de cebada en una solución de preetiquetado no radiactiva durante cinco minutos para preequilibrar las plantas en condiciones de prueba.

Después de eso, sumerja las raíces en la solución de marcaje radiactivo durante cinco minutos. Transfiera las raíces a una solución de desorción durante cinco segundos para eliminar la mayor parte de la actividad de radio adherida a la superficie. A continuación, transfiera las raíces a un segundo vaso de precipitados con solución de desorción durante cinco minutos.

Para limpiar aún más las raíces del trazador extracelular, diseccione y separe los brotes, los brotes basales y las raíces. Coloque las raíces en tubos de centrífuga y centrifuga las muestras durante 30 segundos en una centrífuga de grado clínico de baja velocidad. Para eliminar el agua superficial e intersticial, pese las raíces para obtener el peso fresco.

Mida la radiactividad en las muestras de la planta usando un contador gamma, calcule el flujo de entrada a la planta usando esta fórmula. Comience este procedimiento preparando la solución de etiquetado y midiendo el nudo S como se muestra anteriormente. Después de medir, agregue 19 mililitros de agua a cada muestra de modo que el volumen final sea igual al volumen EIT de 20 mililitros.

Cuente la actividad de radio en cada muestra de 20 mililitros. Sumerja las raíces en la solución de etiquetado durante una hora. Después de una hora, retire las plantas de la solución de etiquetado y transfiéralas al embudo FLX, asegurándose de que todo el material de las raíces esté dentro del embudo.

Asegure suavemente las plantas al costado del embudo de eflujo aplicando una pequeña tira de cinta adhesiva sobre el collar de plástico Vierta suavemente el primer elu en el embudo. Inicie un temporizador para contar en segundos y, después de 15 segundos, abra el grifo y recoja el EIT en el vial de muestra. Cierre la espita y vierta suavemente el siguiente EIT en el embudo.

De esta manera, recoja el EIT para el resto de la serie Elucian durante un período total de la UE de 29,5 minutos. Una vez que se complete el protocolo de la UE, se cosecharán las plantas como se mostró anteriormente, se contará la actividad de radio en los EIT y las muestras de plantas utilizando el contador gamma, multiplicando la lectura de cada EIT por el factor de dilución que grafique la liberación del trazador en función del tiempo de elución para condiciones de estado estacionario, realizar regresiones lineales y cálculos de flujos. Medias mentiras de cambio y tamaños de piscina.

Aquí se muestran isotermas representativas de la afluencia de amoníaco en función de las diferentes concentraciones externas de amoníaco. En las raíces intactas de las plántulas de cebada cultivadas con alto contenido de amoníaco o amonio, y los flujos de amoníaco con bajo o alto contenido de potasio fueron significativamente más altos con bajo contenido de potasio. Los análisis de Menin de las isotermas revelan que el potasio alto tiene relativamente poco efecto sobre la afinidad del sustrato de los transportadores de absorción de amoníaco, pero reduce significativamente la capacidad de transporte.

El siguiente resultado pone de manifiesto la rápida plasticidad del sistema de absorción de potasio. En raíces de plántulas de cebada intactas cultivadas con moderado potasio y alto contenido de amonio. Se observó un aumento de casi el 350% en la afluencia de potasio a los cinco minutos de la retirada de amonio de la solución externa.

Este efecto de extracción de amonio fue sensible a los bloqueadores de los canales de potasio, el tetraetilo amonio bario, un cesio. Estos gráficos muestran el potasio 42 efl en estado estacionario en raíces de plántulas de cebada intactas cultivadas con bajo contenido de potasio y nitrato moderado, y los efectos inmediatos de cloruro de cesio 10 milimolar, sulfato de potasio cinco milimolares y sulfato de amonio cinco milimolares en FLX El potasio FLX fue inhibido por cesio o potasio, pero estimulado por amonio. Cate también se puede utilizar para estimar las concentraciones y los tiempos de renovación del sustrato en los compartimentos subcelulares.

El análisis de regresión de la fase de intercambio lento de la liberación de trazadores junto con la retención de trazadores en los tejidos vegetales puede revelar información importante sobre el tamaño del grupo y las vidas medias de intercambio de componentes subcelulares como la pared celular, el citoplasma y el VA. Esta tabla muestra los parámetros del cabo extraídos de las mediciones de potasio en estado estacionario 42 flx en plántulas de cebada cultivadas con un milimolar de nitrato o 10 milimolar de amonio. Esto último representando un escenario tóxico.

El alto contenido de amonio provoca la supresión de todos los fundentes de potasio y una disminución significativa en el tamaño de la piscina. Una vez dominada, la eficiencia de la metodología DI se puede mejorar escalonando los tratamientos con 30 segundos de diferencia. Al hacerlo, podemos examinar hasta 10 condiciones en un solo experimento.

Del mismo modo, se pueden realizar varias carreras de Kate simultáneamente si hay suficiente tiempo entre carreras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los flujos de nutrientes e intoxicantes en plantas intactas mediante el uso de trazadores radiactivos.