El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

El objetivo general de este procedimiento es seleccionar y aislar las células madre de cáncer de ovario resistentes a la quimioterapia o CSC. Esto se logra marcando primero con fluorescencia líneas celulares de cáncer de ovario con proteína fluorescente roja o RFP y seleccionando células positivas para RFP mediante clasificación de células activadas por fluorescencia o fact. El segundo paso del procedimiento es tratar las líneas celulares de cáncer de ovario con cisplatino quimioterapéutico durante 72 horas y luego cultivar las células sobrevivientes en medios CSC.

Después de dos días, se formarán los esteroides que no se adhieren. A continuación, las CSC se caracterizan mediante el análisis de expresión génica para marcadores de células madre y las CSC se analizan para marcadores de superficie celular mediante citometría de flujo. En última instancia, el análisis de las CSC para la respuesta terapéutica se logra mediante el tratamiento de las células con cisplatino o paclitaxel y la realización de un ensayo MTT para medir la viabilidad.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el tratamiento de las células cancerosas con altas dosis de paclitaxel y cisplatino, es que nuestro método produce más células viables y utiliza cantidades menos tóxicas de agentes quimioterapéuticos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la mejora de la terapia del cáncer de ovario, ya que las CSC representan una población terapéuticamente resistente que necesitará nuevas modalidades de tratamiento. Este método también se puede aplicar a otros sistemas como el cáncer de páncreas, el cáncer de mama y otros tipos de tumores con células terapéuticamente resistentes.

Junto con Jennifer Demostrando esta técnica estará el Dr. Leroy, un postdoc de mi laboratorio. Para empezar, propague las líneas celulares Skov tres y O tosa 4 2 9 en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de CO2 y cultive las células entre 40 y 50% de fluidez. Para generar SCV, tres células que expresan proteína fluorescente roja o RFP, agregue partículas lentivirales que expresan RFP y 10 microgramos por mililitro de policerebro a SCV tres medios en ausencia de penicilina y estreptomicina durante 72 horas.

Después de 72 horas, seleccione las células positivas para RFP mediante clasificación de células activadas por fluorescencia o los datos primero por RFP de tripsina y células que no expresan RFP, luego centrifugar a 125 veces G durante cinco minutos después de la centrifugación, resuspender las células a 10 millones de células por mililitro en PBS que contiene 0.1% BSA en un clasificador de células. Utilice celdas que no sean RFP para determinar los parámetros de ordenación. A continuación, recoja las células que expresan una alta RFP utilizando un láser de 561 nanómetros para enriquecer las células madre cancerosas.

Trate las líneas celulares SCV tres, SCV tres RFP o O tosa 4 2 9 con 20 micromolares de cisplatino quimioterapéutico durante 72 horas. A continuación, la tripsina son las células y el cultivo de células supervivientes en medios CSC. Cambie el medio cada dos días centrifugando las células a 125 veces G durante cinco minutos y Resus suspendiendo el pellet en medio CSC fresco, verifique la viabilidad de las células cada dos días contando las células y realizando la exclusión de azul triano.

Recoja las CSC para experimentos posteriores centrifugando como antes y vuelva a suspender el pellet en la solución adecuada. Monitoriza la morfología de las células CSC utilizando un microscopio óptico con aumentos de 20 y 40 aumentos. Para caracterizar primero las CSC, recoja tres preparaciones de CSC centrifugando medios que contengan células a 125 veces G durante cinco minutos.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en una solución de fenol que contenga tiocianato de indio gu. Para la extracción de ARN, sintetice ADN complementario o CD NA de 0,1 a un microgramo de ARN utilizando un kit de transcripción inversa CDNA disponible en el mercado. A continuación, realice la reacción en cadena de la polimerasa transcrita inversa cuantitativa, abreviada Q-R-T-P-C-R como se detalla en el protocolo de texto.

Realice todos los Q-R-T-P-C-R por duplicado para cada muestra utilizando un termociclador de PCR en tiempo real capaz de detectar múltiples fluoróforos. Como paso final, normalice la expresión génica de las células madre para que quede entre la expresión de DH en cada muestra. Utilizando el método CT delta delta.

Coseche las CSC recolectando medios que contengan células y centrifugando a 125 veces G durante cinco minutos. Agregue 500 microlitros de una solución de desprendimiento de células no proteolíticas para romper las células antes de centrifugar nuevamente para eliminar la solución de desprendimiento de células. A continuación, lave las celdas dos veces con PBS frío.

Incubar las células en un medio de crecimiento normal durante una hora antes de etiquetar las células después de girarlas. Al igual que antes, vuelva a suspender las células en PBS con 0,1%BSA que contenga anti CD 1 33 PE y anti CD one 17 FE. A continuación, fije las células durante la noche en formaldehído al 1%Para, realice una citometría de flujo para analizar la expresión de la superficie celular CD one 17 y CD 1 33. Recopile datos sobre las celdas en los canales FL uno y FL tres y genere puertas para las celdas que expresan tanto fits E como pe.

Genere un diagrama de puntos con cuatro cuadrantes y determine el número de celdas en cada placa de cuadrante. 5.000 células por pocillo para cada variante de celda en placas de 96 pocillos durante la noche. A continuación, trate las células con varias concentraciones de cisplatino o paclitaxel durante 96 horas.

Después de 96 horas, agregue 10 microlitros de 10 miligramos por mililitro. MTT incuba a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas hasta que se forma precipitado para solubilizar. MTT. Añadir el disolvente MTT, una solución que contiene cuatro milimolares de ácido clorhídrico y 0,1%NP 40 en isopropanol.

Después de la incubación durante 15 minutos en la oscuridad, lea las placas a 570 nanómetros en un lector de placas para demostrar que las CSC se aislaron de líneas celulares epiteliales de cáncer de ovario mediante tratamiento con cisplatino. Las imágenes de las líneas celulares se adquirieron antes del tratamiento y, después de la selección, la microscopía óptica capturó imágenes de adherencia. Las células SCV tres y OCA 4 2 9, así como las CSC SCV tres y las CSC OCA 4 2 9 Las CSC aparecen redondas y no se adhieren a las placas de cultivo de tejidos.

SCV: tres células transducidas con RFP conservan su fluorescencia después del aislamiento de las CSC, lo que demuestra que las células son viables. Viable. Se evaluó la respuesta de los cultivos de CSC al tratamiento farmacológico. Las CSC demostraron una mayor resistencia a la expresión de cisplatino y paclitaxel de los genes de las células madre.

Se examinó el CD 1 33 NEIN nano y T cuatro. En los experimentos iniciales. T four nano y nein se elevaron en S SCV tres cultivos de CSC en comparación con los no tratados, pero los resultados no fueron estadísticamente significativos.

CD 1 33 fue inducida significativamente en SCV tres cultivos de CSC en comparación con las células no tratadas. Al repetir estos experimentos, T four y nano aumentaron en S SCV tres CSC en comparación con las células de control parental. SCV tres, las CSC exhiben una mayor expresión en la superficie celular del marcador CSC CD uno 17 como lo reveló el análisis por fax Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la principal limitación de este protocolo es la cantidad de tiempo que las CSC permanecen viables.

Con este protocolo, el CSC sigue siendo viable durante menos de una semana. Por lo tanto, los tipos de experimentos y análisis para los CSC deben programarse cuidadosamente. No olvide que trabajar con cisplatino puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de ropa protectora y evitar el contacto con la piel y las membranas mucosas después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la exclusión de azul de triam, para responder preguntas adicionales sobre la viabilidad de la célula, así como ensayos de dilución limitante para demostrar las características promotoras tumorales de las CSC después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer exploraran las vías que conducen a la resistencia a la quimioterapia.