Name: Una Ex Vivo Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprende a evaluar la degeneración axonal aguda en tiempo real mediante microscopía de dos fotones en tejido espinal ex vivo. Este método permite visualizar dinámicas de lesiones axonales y de mielina con integridad tisular preservada.

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DPS reconoce el apoyo pasado y presente en parte de la subvención #2665 y #2934, respectivamente, de la Fundación de Investigación PVA. PKS es un Alberta Innovates – Health Solutions Scientist, los fondos operativos fueron proporcionados por la Cátedra Leblanc para la Investigación de la Médula Espinal de la Universidad de Calgary.

NOTA: Todos los animales procedimientos se realizaron bajo las directrices establecidas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional de la Universidad de Louisville, conforme a las normativas federales. 1. Preparación de Baja Ca 2+ y 2 mM de Ca 2+ líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) perfundidos <ol><li> Preparar 2x bajo Ca 2 + (0,1 mM) Stock tampón C, 2x Ca normales 2+ (2 mM) Stock un tampón, y tampón 2x Stock B como se describe en la Tabla 1. Las soluciones madre individuales permiten la modificación del contenido de iones (por ejemplo, bajo o cero Ca 2+) y puede almacenarse a 4 ° C durante un máximo de un mes. </li><li> Para la perfusión intracardiaca durante la disección, añadir 100 ml de 2x bajo Ca 2+ Stock C y 100 ml de 2x Stock B en una botella de plástico a fin de bajo Ca 2 + 1x LCRa. Mezclar y guardar toda la noche a 4 ° C o hacer fresco. </li><li> Para la perfusión ex vivo de la médula espinal durante imagING, añadir 500 ml de 2x normal de Ca 2+ Stock A y 500 ml de 2x Stock B en una botella de vidrio de 1 L para generar 1x LCRa. Mezclar y almacenar durante la noche a temperatura ambiente o hacer fresco. </li><li> Ajustar el pH de los tampones aCSF a 7,4. Mientras se mantiene el LCRa a temperatura ambiente, colocar el bajo Ca 2 + LCRa en hielo y luego burbuja ambos buffers con gas carbógeno (95% O 2; 5% de CO 2) durante 30 min antes de su uso y continuamente durante la perfusión. </li></ol> 2. Preparación de Ex Vivo cámara de imágenes <ol><li> Envuelva una manta de calefacción (sin apagado automático) alrededor de la botella LCRa y ajustar el fuego a bajo entorno / medio. </li><li> Inserte una línea dedicada de perfusión LCRa en la botella conectado a una bomba de perfusión y calentador en línea que es controlada por una sonda de temperatura controlador de temperatura y la retroalimentación bipolar como se muestra en la Figura 1A. </li><li> Adjunte una etapa de inserción microscopio plana (152 x 102 mm) a la de 2 fotones de excitación / confplatina del microscopio vecinal equipado con un contenedor de derrame. </li><li> Colocar una cámara de perfusión en baño abierto grande (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) en el recipiente de derrame para acomodar y proporcionar un flujo continuo de fresca oxigenada LCRa a la médula espinal ex vivo (véase la Figura 1B para una ex adecuado vivo de imágenes diseño de la cámara). </li><li> Conectar el puerto de salida de metal del calentador en línea a la cámara de formación de imágenes ex vivo usando un tubo apropiado. Coloque una almohadilla absorbente delgada debajo de la cámara de formación de imágenes ex vivo para ayudar a mantener la temperatura del tampón / tejido durante la formación de imágenes. </li><li> Adherir la cámara de formación de imágenes ex vivo a la parte inferior del inserto recipiente derrame / etapa usando extraíble tachuela pegajosa. La maleabilidad de la tachuela pegajosa permitirá que la cámara sea ajustada como sea necesario para asegurar la trayectoria de la luz del objetivo es perpendicular a la superficie del tejido. Si es necesario, utilice un nivel diana para ajustar la cámara. </li><li> Asegure unsonda en-línea de realimentación calentador de temperatura cerca de la cámara de entrada de fluido y un tubo de succión de acero inoxidable conectado a una línea de vacío en la salida de la cámara. Titulares de cinta magnética y micropipeta apropiada son útiles a este respecto. Encienda la fuente de vacío. </li><li> Encienda la bomba de perfusión para comenzar a llenar la cámara de imágenes con LCRa oxigenada. Ajuste la bomba de perfusión de 1,5 a 2 ml por min. </li><li> Controlar el volumen de LCRa en la cámara de formación de imágenes mediante el ajuste de la línea de vacío. Es importante que haya suficiente LCRa en la cámara de formación de imágenes para cubrir el segmento de la médula espinal y permitir suficiente distancia de trabajo entre un objetivo de inmersión de agua y la superficie del tejido. La mielina y axones pueden verse afectadas negativamente si el segmento de tejido no está completamente sumergido en fresco oxigenada LCRa líder artefactos inducidos por el experimentador. </li><li> Ajuste el controlador de temperatura del calentador en línea para que la temperatura perfundido en la cámara de formación de imágenes es a temperatura ambiente. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Disección de adulto murino cervical de la médula espinal <ol><li> La eutanasia a un adulto 6-10 semanas de edad thy1-YFP ratón transgénico (uso cepa apropiada que tiene la expresión de la proteína fluorescente en las neuronas ganglionares de la raíz dorsal) mediante la inyección de una sobredosis de la anestesia pentobarbital sódico (200 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal. </li><li> Una vez bajo el nivel adecuado de anestesia (por ejemplo, ninguna reacción a pizca dedo del pie y pérdida de reflejo de parpadeo), afeitado cuidadosamente la piel que cubre la médula espinal y el cerebro con una maquinilla quirúrgicos. Limpie la piel usando betadine y 70% de etanol almohadillas. </li><li> Rocíe pecho / área del abdomen con etanol al 70%, entonces perfundir el tema transcardially usando refrigeradas, bajo Ca carbógeno-burbujear 2+ LCRa. (Vea la figura 1C para banco de disección sugerido superior configurado). </li><li> Como palidece el hígado, asegure la aguja de perfusión en el corazón con un pequeño clip. Gire el tema para tener acceso al lado dorsal afeitada deel sujeto y limpie la zona afeitada con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en la piel dorsal a lo largo de la línea media a partir de la nariz a la cadera utilizando tijeras de disección para exponer el cerebro y la columna vertebral (Figura 2). Asegurar la preparación mediante la colocación de pasadores en la nariz y la cadera. </li><li> Utilizando un microscopio de disección partir de este punto, firmemente cortar a través de la superficie dorsal del cráneo a nivel de los bulbos olfativos. Inserte una de las puntas de las tijeras en los bordes laterales de la incisión y cortar a lo largo de los bordes de la bóveda del cráneo bilateralmente hasta el cerebelo. NOTA: No extirpar completamente la bóveda del cráneo, ya que se necesita después de levantar el tejido que recubre desde la médula espinal a lo largo de la disección (ver Figura 2B). </li><li> Levante la tapa del cráneo para exponer el cerebro. Cortar suavemente los bordes izquierdo y derecho de la médula interparietal (situado en el cerebelo) y tire de él hacia atrás en sentido caudal para exponer el tronco cerebral / de la médula espinal (Figura 2C </strong&gt;). </li><li> Con unas tijeras de punta fina celebradas en un ángulo de 45 ° respecto a la superficie de la mesa y cortar las vértebras bilateralmente justo por debajo de las raíces nerviosas posterior. NOTA: Evite el contacto con las columnas dorsales de color blanco brillante. Estas fibras son las que serán fotografiadas (Figura 2D) y se pueden dañar fácilmente. </li><li> Levante la superficie de casquete y dorsal de la columna vertebral con unas pinzas de punta fina, tirando suavemente el tejido suprayacente en una sola pieza como se hacen cortes para exponer la médula espinal. Continuar para cortar las vértebras a nivel torácico superior para aislar un segmento de 1-2 cm de la médula cervical para la posterior formación de imágenes (Figura 2E). </li><li> Utilice unas tijeras para cortar el paralelo tejido / hueso de la columna vertebral y el tejido transparente debajo de la columna. Hacer estos recortes como nivel posible. Es muy importante que el tejido esté plana en la cámara de modo que el cable es el nivel de formación de imágenes. </li><li> Utilice un bisturí # 11 para seccionar el tronco cerebral (más allá de lala terminación de las fibras fascículo gracile) y en el nivel superior torácica para aislar el segmento de la médula espinal cervical (Ver Figura 2F). Utilice unas tijeras para cortar el tejido / hueso en estos mismos dos puntos. El tejido aislado debe contener 2/3 de la columna vertebral que abarca el tronco cerebral caudal, la ampliación cervical, y la médula espinal torácica superior (Figura 2G). </li><li> Colocar la columna vertebral aislado en una placa Petri de carbógeno-burbujeó, bajo Ca 2 + LCRa refrigerada. Si es necesario, cortar el tejido debajo de la columna vertebral hasta que quede plana en el plato. </li><li> Transferir la columna vertebral aislada a la cámara de formación de imágenes ex vivo y aumentar gradualmente la temperatura perfundido durante 1 hora a 36-37 ° C. Mantener esta temperatura durante la exploración. </li></ol> 4. Colocación de los ex vivo de la médula espinal en la Cámara de Imágenes e mielina Etiquetado con Rojo Nilo <ol><li> Asegurar cuidadosamente la columna vertebral en el icámara maging con una rodaja de ajuste apropiado mantenga presionada modificado con una plataforma de rejilla vertical que consiste en hilos de lycra fina (quitar las hebras medias de rejilla plataforma para dar espacio a la médula espinal; ver Figura 3A). </li><li> Descongelar una alícuota de Rojo Nilo (madre 5 mM en DMSO y 0,22 micras filtrada; pueden almacenarse durante 1 mes a 4 ° C, o 6 meses a -20 ° C en la oscuridad). Justo antes de la adición de Rojo Nilo a la cámara de formación de imágenes, reducir el flujo de la bomba de perfusión y ajustar la línea de vacío para asegurar el fluido en la cámara siempre cubre la médula espinal. </li><li> Añadir 5-10 l solución madre de Rojo Nilo a la cámara de formación de imágenes cerca del extremo caudal de la cuerda (Figura 3B). Utilice una pipeta de 1 ml para mezclar suavemente Rojo Nilo en toda la cámara. Permita Rojo Nilo para permanecer en la cámara durante 1-2 minutos, luego coloque la línea de vacío, retroceder y ajustar la bomba de perfusión de 1,5 a 2 ml por minuto para la perfusión continua de la médula espinal. </li><li> Levante con cuidado la platina del microscopioy alinear el objetivo con el centro del segmento de la médula espinal y medialmente sobre las columnas dorsales hasta que el objetivo de inmersión en agua es de aproximadamente 10 mm de la superficie de la LCRa en la cámara. Utilice el microscopio rueda de enfoque revólver para llevar lentamente el objetivo hasta que toque suavemente la superficie de la LCRa. Utilice una fuente de luz de epifluorescencia para enfocar las columnas dorsales en el campo de visión (Figura 3C). </li></ol> 5. Ex vivo de imágenes de la médula espinal de ratón con TPLSM y la médula espinal inducida por láser Lesiones (Lisci) NOTA: La vena posterior proporciona un marcador útil para centrar el tejido a medida que las fibras fascículo grácil (originados por el cuerpo celular de ganglios de la raíz dorsal y ascienden desde T6 y por debajo a lo largo de la línea media de la médula espinal) en paralelo a este vaso sanguíneo. Los más gruesas YFP + proyecciones de la raíz dorsal cervical también proporcionan un marcador útil como fibras ascienden y descienden lateralmente a la YFibras de PF + fascículo grácil que son más pequeños de diámetro. <ol><li> Una vez que el tejido de la médula espinal está alineado apropiadamente, cambie al modo de escaneo láser para realizar las imágenes de referencia de el fascículo grácil fibras mielinizadas ascendentes. Para excitar tanto YFP y Rojo Nilo, utilizar una fuente de láser de dos fotones sintonizado a 950 nm de longitud de onda (~ 17 mW medida en la salida de un 25X, 1,1 objetivo NA) y dicroicos apropiados (DM) y los filtros de paso de banda para aislar la emisión fluorescente de los fluoróforos (usamos DM560 525/50, 600/60 DM640, y 685/70, para separar YFP, y Rojo Nilo en amarillo-naranja, y canales rojo extendidas, respectivamente). <ol><li> Si más de 3% de los axones muestran esferoides axonales durante la exploración de línea de base (30-60 min), desechar la preparación debido a los artefactos inducidos por el experimentador. </li></ol></li><li> Inducir un aumento Lisci por el campo de visión a 30.3X (para crear una ablación ~ 20 m de diámetro). Tune el láser a 800 nm, y aumentar la potencia del láser a ~ 110 mW ala muestra. Permitir 5 campo completo de exploraciones visión láser para asegurar fibras están completamente seccionados. </li><li> Confirme Lisci cambiando la configuración de láser a los ajustes de imagen (950 nm, 17 mW en la muestra, 2.08X) y escanear el tejido de visualizar la ablación. Compruebe el diámetro de la ablación y que los axones primarios ablación se secciona completamente (véase la figura 3D). Utilice la configuración de lapso de tiempo en el microscopio combinado con captura z para registrar la respuesta dinámica de los axones y mielina a la lesión hasta 10.8 + horas después del daño. NOTA: Si la ablación es incompleta (es decir, la transección incompleta de fibras), desechar la preparación, como la determinación de los mecanismos de lesión primaria y secundaria se confundió. Además, aislados segmentos de la médula espinal se pueden obtener imágenes de hasta 24 horas después de la Lisci con sólo leves daños en los tejidos Lisci-independiente a moderada. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe un método de formación de imágenes ex vivo de la médula espinal axones mielinizados (es decir, fascículo gracile) combinado con una lesión de la médula espinal inducida por láser para estudiar la dinámica de la progresión de la degeneración axonal tanto mielinizadas primaria y secundaria con el tiempo. Ex vivo de imágenes de la superficie de la médula espinal supera muchas de las complicaciones asociadas con la formación de imágenes in vivo tales como artefactos de movimie...

La degeneración de los axones es una causa importante de morbilidad que abarca varias condiciones neurológicas incluyendo neurotrauma, accidente cerebrovascular, enfermedades autoinmunes, y enfermedades neurodegenerativas. A diferencia del sistema nervioso periférico (PNS), el sistema nervioso central (SNC) axones tienen una capacidad limitada para regenerar una vez heridos debido tanto a las barreras intrínsecas y extrínsecas (es decir, moléculas inhibidoras del crecimiento axonal producido durante la formación de la cicatriz y liberado durante la degeneración de mielina) 1 -7. Aunque varias de estas barreras se han explorado ampliamente, las intervenciones terapéuticas dirigidas a prevenir CNS degeneración axonal, promover la regeneración axonal robusta, y restaurar connectively funcional, siguen siendo limitados. Los axones una vez separados de su soma someten a un proceso estereotipada de la degeneración conocida como degeneración walleriana que se caracteriza por hinchazón axonal, la formación de esferoides y eventual fragmentación (revisado en 8). EnPor el contrario, el muñón proximal que permanece en continuidad con el soma de un axón periférico seccionado, forma una hinchazón en su extremo, muere de nuevo al nodo más cercano de Ranvier y, a continuación puede iniciar la formación del cono de crecimiento, un requisito previo vital necesaria para la regeneración axonal subsiguiente 9-11. En contraste, las terminaciones axonales proximales de muchos axones centrales forman &quot;endbulbs&quot; característicos o bombillas de retracción, no se forman conos de crecimiento, y en lugar de retraer lejos del sitio de la lesión donde permanecen durante meses después de la lesión 12-15. Además de la lesión axonal primaria, daño axonal / pérdida adicional también puede ocurrir a los axones que se salvaron en gran parte de la lesión inicial. Esta pérdida axonal retraso de los axones librado inicialmente se denomina degeneración axonal como secundario. Esta respuesta inherente de los axones del SNC a una lesión hace que la regeneración axonal funcional un objetivo aún más difícil de lograr en el cerebro y la médula espinal. Aunque hallmarks de lesión axonal (por ejemplo, la formación de esferoides, bombillas de retracción) han sido bien caracterizados a partir de modelos experimentales de la degeneración axonal tejido post-mortem y, elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos dinámicos ha sido restringido. La mayoría de estos estudios se basó en observaciones de punto final estáticas que intrínsecamente no lograron capturar respuestas axonal individuales en el tiempo. Aunque aplicadas exógenamente trazadores axonal han sido útiles para dilucidar las respuestas axonal de secciones estáticas y durante imágenes en vivo, la disponibilidad de marcadores axonal codificados genéticamente ha mejorado en gran medida nuestra capacidad de visualizar los axones en tiempo real, utilizando microscopía de fluorescencia. De hecho, un informe seminal de Kerschensteiner y colegas proporcionan primera evidencia directa de la degeneración axonal y la regeneración in vivo utilizando ratones Thy1 GFP-S que codifican la proteína fluorescente verde en subconjuntos de neuronas que envían sus proyecciones en las columnas dorsales de la médulacable de 16. Imágenes en vivo enfoques utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (TPLSM) y genéticas etiquetado proteína fluorescente de células de interés continúa proporcionando evidencia directa y visión mecanicista en muchos diversos procesos dinámicos tales como la degeneración axonal, Ca 2 + señalización, la regeneración axonal, la fisiología de los astrocitos, fisiología microglial, y la respuesta a la lesión 17-25. A diferencia de los axones, se sabe muy poco de las respuestas a la lesión de la mielina en tiempo real. La mielina es un componente vital de la sustancia blanca producida y mantenida por los oligodendrocitos en las células del sistema nervioso central y de Schwann en el SNP. La mielina aísla 99% de la superficie de los axones y de esta manera proporciona una alta resistencia, la cubierta protectora de baja capacitancia que soporta rápida y eficaz la propagación del impulso saltatoria, revisado recientemente por Buttimore et al., 26. Para capturar la respuesta dinámica de la mielina a las lesiones usamos la solvatocrómico, lipófilocolorante fluorescente Nilo 27 Red. Las propiedades solvatocrómico de este colorante vital permiten desplazamientos espectrales de su espectro de emisión que es dependiente del entorno físico-químico 28,29. Estas propiedades son útiles para comprender mejor los mecanismos de lesión axomyelinic y pueden ser visualizados usando dicroicas adecuadamente seleccionados y filtros de emisión o resolverse mediante microscopía espectral 27. Por ejemplo, el espectro de emisión del Rojo Nilo es desplazada al azul en entornos menos polares, ricas en lípidos tales como los encontrados en los adipocitos y la mielina del SNC normal (pico de emisión ~ 580-590 nm) 27. En contraste, los picos del espectro de emisión de este colorante vital en ~ 625 nm en endbulbs formados como axones sufren muerte regresiva axonal 27. Aunque los mecanismos exactos que subyacen a estos desplazamientos espectrales específicamente en endbulbs frente a la mielina normal, siguen sin estar claros, tales cambios espectrales pueden revelar alteraciones subyacentes en la acumulación de proteínas o desorganización que lleva ala exposición de sitios de unión hidrófobos 27. Mientras imágenes in vivo es la métrica final para la observación de la dinámica de la médula espinal de lesión axonal en su entorno nativo, es técnicamente difícil y requiere experiencia quirúrgica considerable y, a menudo repetir cirugías para exponer la columna dorsal que puede introducir artefactos experimentales (por ejemplo, la inflamación y la cicatriz formación). Además, un equipo costoso es a menudo necesaria para permitir la suspensión y posicionamiento de un animal intacto bajo la lente del objetivo de microscopio. Los animales deben ser supervisados ​​cuidadosamente, así como asegurar que se mantienen cálidas, para garantizar los líquidos se reponen, y para garantizar que no haya signos de hipoxia debido a las sesiones de formación de imágenes anestesiados prolongados. Esto último es muy importante como axones y mielina absolutamente requieren perfusión constante y los niveles de oxígeno adecuados para seguir siendo viable. Sin embargo, esto a menudo no se informó ni controlado en la mayoría de los estudios in vivo afecha. Además, los artefactos de movimiento debido a la frecuencia cardíaca y la respiración (isoflurano anestesiados ratón adulto: ~ 300 a 450 latidos por minuto (BPM) es óptima para mantener la saturación de oxígeno 97 a 98% (normal tasa de ~ 632 BPM) y ~ 55-65 respiraciones por minuto (tarifa normal es de ~ 163 respiraciones por minuto), respectivamente)) 30 encontrados durante in vivo de la médula espinal make imágenes diferenciar respuestas lesión axonal primaria y secundaria mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución desafiante ya que incluso los más rápidos escaneos láser inevitablemente están sujetos a estos movimientos artefactos. Los avances en los escáneres de resonancia ultrarrápidos combinados con un vertebral rígida ventana enmarcada implantable puede permitir imágenes de la médula espinal murino en animales despiertos, pero los tiempos de exploración más rápido reducen inevitablemente la relación señal a ruido de calidad de imagen degradante. Otras mejoras en las técnicas de imagen de la médula espinal se utilizan en la actualidad para las imágenes cerebrales pueden superar muchos de estos obstáculos y limitar posibles confusiones introducidas por inala perfusión tisular dequate, por ejemplo, 31-33. Mucho de lo que se conoce sobre blanco fisiología y mecanismos de la lesión de la sustancia blanca cuestión se ha determinado utilizando in vitro o preparados ex vivo de la sustancia blanca del nervio óptico, el nervio periférico, y tiras de la médula espinal de la sustancia blanca 34-41. Estas preparaciones continúan avanzar en el conocimiento de los mecanismos de lesión de la sustancia blanca, ya que permiten cambios en los factores ambientales, la aplicación controlada de fármacos y reactivos, evaluaciones funcionales utilizando electrofisiología, y observaciones de microscopía de fluorescencia directa de los axones y mielina en el tejido vivo controlados. Sin embargo, algunos de los enfoques anteriores para observar los axones de las tiras de la columna dorsal de la médula espinal o las tiras de materia blanca ventral inevitablemente dañar los axones superficiales durante la etapa de eliminación que pueden influir en la respuesta de los axones de cerca opuestos. Para sacar provecho de las manipulaciones experimentales anteriores y evitar daños en el cincofibras ry bajo investigación, utilizamos un modelo de la médula espinal cervical ex vivo, ya que evita el contacto directo de la cara dorsal de la médula. Por lo tanto, la arquitectura de la piamadre y axones columna dorsal superficial adyacentes permanecen viables e imperturbable durante el aislamiento. Aquí se describe un enfoque relativamente simple que permite la visualización directa de los axones mielinizados centrales para que puedan responder dinámicamente a una lesión focal en tiempo real hasta 8 - 10+ horas después del daño. El modelo de lesión medular inducida por láser (Lisci) permite la diferenciación entre los mecanismos de lesión axonal primaria y secundaria como el (lugar de ablación) lesión primaria permanece espacialmente limitadas en el tiempo. La cámara de imágenes en baño abierto es accesible para la intervención terapéutica, la entrega de reactivos y manipulaciones ambientales. Agentes protectores axomyelinic putativos pueden ser evaluados rápidamente en tiempo real por observaciones directas frente a experimentos largos y costosos que implican proceso de tejidoing, seccionamiento, inmunotinción, captura de imágenes, y el análisis y por lo tanto proporciona un modelo sustituto útil para evaluar las respuestas agudas y manipulaciones de protección antes de probar los agentes experimentales en animales vivos.

<table><tbody><tr><td>Gran cámara de baño con soportes de corte</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>Para cámara de imagen ex vivo</td></tr> Standard <tr><td>Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>Para cámara de imagen ex vivo</td></tr><tr><td>Sujetador de plástico Slice para cámaras RC-27L y RC-29</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>Para cámara de imagen ex vivo</td></tr><tr><td>Tubo de succión, serie 20 Diseño clásico, para zurdos</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>Para cámara de imagen ex vivo</td></tr><tr><td>Solución Calentador/enfriador en línea</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>Para regular la temperatura de perfusión durante la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura bipolar</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>Para regular la temperatura de perfusión durante la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Sistema de refrigeración líquida</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>Para regular la perfusión Temperatura durante la adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Conjunto de cables para controladores de calefacción</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>Para regular la temperatura de perfusión durante la generación de imágenes</td></tr><tr><td>Termisitor de cordón de repuesto para cable CC-28</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>Para regular la temperatura de perfusión durante la adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Soporte magnético con tubo de succión</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>Para sujetar la succión al vacío de acero inoxidable tuberías&nbsp;</td></tr><tr><td>Soporte ajustable</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>Para sujetar la sonda de temperatura</td></tr><tr><td>sellador</td><td></td><td></td> de silicona transparente Para cámara de <td>imagen ex vivo</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td> Para cámara de <td>imagen ex vivo</td></tr><tr><td>tiras finas de</td><td></td><td></td> plexiglás Para cámara de <td>imagen ex vivo</td></tr><tr><td>rojo nilo</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>Para etiquetar mielina</td></tr></tbody></table>

una ex vivo médula espinal inducida por láser lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Axones lesionados del SNC no se regeneran y, a menudo retraer lejos del sitio de la lesión. Los axones se salvaron de la lesión inicial más tarde pueden sufrir degeneración axonal secundaria. La falta de formación del cono de crecimiento, la regeneración, y la pérdida de proyecciones axonales mielinizadas adicionales dentro de la médula espinal limita en gran medida la recuperación neurológica después de una lesión. Para evaluar la forma en el centro de axones mielinizados de la médula espinal responden a las lesiones, hemos desarrollado un modelo ex vivo vivir médula espinal utilizando ratones transgénicos que expresan la proteína amarilla fluorescente en los axones y una focal y lesión medular inducida por láser altamente reproducible para documentar el destino de axones y mielina (colorante fluorescente lipofílica Rojo Nilo) con el tiempo utilizando excitación de dos fotones time-lapse microscopía. Los procesos dinámicos tales como lesión aguda axonal, la retracción axonal, y la degeneración de la mielina están mejor estudiados en tiempo real. Sin embargo, la naturaleza no focal de las lesiones a base de contusión y artefactos de movimiento encontródurante in vivo de la médula espinal make imágenes diferenciar respuestas lesión axonal primaria y secundaria utilizando microscopía de alta resolución desafiante. El modelo ex vivo de la médula espinal aquí descrita replica varios aspectos de la contusión / patologías axonal clínicamente relevantes inducida por compresión, incluyendo inflamación axonal, la formación de esferoides, transección axonal, y peri-axonal hinchazón proporcionando un modelo útil para estudiar estos procesos dinámicos en tiempo real. Las principales ventajas de este modelo son una excelente resolución espacial y temporal que permite la diferenciación entre el insulto primaria que lesiona directamente los axones y los mecanismos de lesión secundaria; infusión controlada de reactivos directamente al baño perfundido el cable; alteraciones precisas del medio ambiente (por ejemplo, calcio, iones de sodio, los contribuyentes que se sabe que la lesión axonal, pero casi imposible de manipular en vivo); y modelos murinos también ofrecen una ventaja, ya que proporcionan la oportunidad de visualizar ymanipular las poblaciones de células identificadas genéticamente y estructuras subcelulares. A continuación, describimos cómo aislar e imagen viviente de la médula espinal de los ratones para capturar la dinámica de lesión axonal aguda.

Los detalles de un laboratorio adecuado establecido necesario para aislar, mantener la viabilidad, y la imagen de la médula espinal ex vivo se muestran en la Figura 1. El microscopio debe estar equipado con un láser sintonizable de impulsos de femtosegundo, dicroics apropiados y filtros de emisión, y un agua sumergiendo lente objetivo con una apertura numérica (≥1.0). Para asegurar la viabilidad de la médula espinal durante la disección, el procedimiento se debe realizar en la presencia de frío...

Presentamos un protocolo que utiliza microscopía de lapso de tiempo de excitación de dos fotones para visualizar simultáneamente la dinámica de las lesiones de axones y mielinas en tiempo real. Este protocolo propuesto permite estudiar los factores intrínsecos y extrínsecos que pueden influir en el destino de los axones mielinizados centrales después de una lesión y contribuir a la discapacidad clínica permanente.

Una Ex Vivo Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los mecanismos de degeneración axonal aguda en tiempo real. Esto se logra aislando el muslo de un tejido neuro y de la médula espinal YFP positivo, mientras se perfunde continuamente el tejido con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado con bajo contenido de calcio. Luego, el tejido de la médula espinal se alinea bajo un objetivo de microscopio de dos fotones mientras se mantienen las condiciones fisiológicas, y la mielina se tiñe con el tinte fluorescente lipofílico rojo del Nilo.A continuación, se crea una lesión de tamaño micros en la superficie dorsal de una columna dorsal ajustando la potencia del láser para seccionar los axones mielinizados dentro de las columnas. Los resultados muestran la retracción de los axones dañados, periaxonal, hinchazón de mielina y otras respuestas celulares basadas en mediciones cuantitativas de las imágenes. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que utilizamos toda la médula espinal cervical y, por lo tanto, las fibras de la columna dorsal permanecen intactas.Por lo tanto, esto evita el daño a las fibras mielinizadas centrales subyacentes, que comúnmente ocurre durante la preparación de la tira de materia blanca. La demostración de este procedimiento estará a cargo del Dr. Starlin ada, un becario postdoctoral en mi laboratorio que realmente defendió esta técnica para prepararse para la perfusión intracardíaca. Producir líquido cefalorraquídeo artificial con bajo contenido de calcio o líquido cefalorraquídeo A con soluciones BNC dos veces concentradas para la profusión de la médula espinal ex vivo.Durante la toma de imágenes, prepare el líquido cefalorraquídeo A normal con dos soluciones madre A y B en un frasco de vidrio. Ofrezca estas soluciones a pH 7.4. Mantenga el líquido cefalorraquídeo A bajo en calcio refrigerado cerca del área de disección y mantenga el líquido cefalorraquídeo A normal a temperatura ambiente cerca del microscopio.Burbujee ambas soluciones con el automóvil y la gasolina durante media hora antes de usarlas y burbujee continuamente mientras estén en uso. A continuación, prepare la cámara de perfusión del baño abierto para la obtención de imágenes. Primero, conecte la salida de metal de los calentadores en línea a la cámara.A continuación, adhiera la cámara de imágenes a la cámara de derrames con una buena cantidad de material pegajoso para que pueda ajustar ligeramente la posición de la cámara de imágenes. Asegure la sonda de temperatura de retroalimentación de los calentadores en línea cerca de la entrada de fluido y asegure el tubo de succión de acero inoxidable a la línea de vacío en la salida de la cámara. Ahora encienda la bomba de vacío y la bomba de perfusión.Una vez que la cámara se llene con un líquido cefalorraquídeo A, reduzca la bomba a 1,5 a dos mililitros por minuto. A continuación, controle el volumen A CF en la cámara mediante la posición de la línea de vacío. Para ajustar, la eutanasia de seis a 10 semanas de edad TH un ratón transgénico YFP.Primero, confirme que no hay una respuesta reflexiva de pellizco del dedo del pie. A continuación, afeita la zona que cubre la médula espinal y el cerebro. Después del afeitado, limpie la piel expuesta con Betadine y etanol al 70%.Ahora rocíe el pecho y el área abdominal con etanol al 70% y perfunda el trans Cardi animal con carbogen burbujeado en CSF bajo en calcio A. Cuando el hígado comience a palidecer, conecte la aguja de perfusión en el corazón con una pinza. A continuación, voltee al animal y limpie el lado dorsal de la piel con etanol al 70%.Haga una incisión a lo largo de la línea media desde la nariz hasta la cadera para exponer la capa del cráneo y el tejido por encima de las vértebras. Use alfileres para apartar la piel y asegurar al animal en la nariz y la anca. Ahora traslade la preparación a un microscopio de disección con tijeras firmemente cortadas a través de la superficie dorsal del cráneo a la altura de los bulbos olfatorios.Inserte la punta de las tijeras en la incisión recién hecha y corte a lo largo de ambos bordes del casquete del cráneo para exponer el cerebelo. No extirpe completamente el casquete craneal. Levante la tapa del cráneo que deja al descubierto el cerebro y corte con cuidado los bordes izquierdo y derecho del hueso interparietal sobre el cerebelo.Ahora, mientras tira suavemente de la capa del cráneo y la superficie de la columna vertebral dorsal, haga cortes justo por debajo de las raíces nerviosas posteriores para exponer aún más la médula espinal. Luego, con unas tijeras de punta fina, corte con cuidado las vértebras bilateralmente. En un ángulo de 45 grados, es vital evitar daños en las columnas dorsales.Estas fibras blancas brillantes se dañan fácilmente sin tener cuidado, continuando tirando suavemente hacia atrás el hueso y el músculo extirpados mientras se cortan las vértebras. Corte de uno a dos centímetros para aislar un segmento de tejido de la médula espinal cervical adecuado para la obtención de imágenes. Luego, use tijeras para cortar el tejido y el hueso paralelos a la columna vertebral.También limpie el tejido debajo de la columna. Haga estos cortes lo más nivelados posible porque es muy importante que el tejido quede plano en el nivel de la cámara para la obtención de imágenes. Finalmente, use el bisturí número 11 para atravesar el tronco encefálico más allá de la terminación de las fibras de la hierba ulu y en el nivel torácico superior.Luego use unas tijeras para cortar el tejido y el hueso en estos dos puntos. El tejido aislado debe contener dos tercios de la columna vertebral que abarca el tronco encefálico cordal, el agrandamiento cervical y la médula espinal torácica superior. Transfiera la columna vertebral aislada a la cámara de imágenes ex vivo y aumente gradualmente la temperatura de perfusión a entre 36 y 37 grados Celsius durante la próxima hora.Mantenga esta temperatura durante la toma de imágenes. Un aspecto crítico de este protocolo es asegurarse de aislar la médula espinal sin dañar las fibras de la columna dorsal. El segundo aspecto más crítico de este protocolo es garantizar que la médula espinal esté continuamente perfundida con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado.Con un portaobjetos de tejido modificado, asegure cuidadosamente la columna vertebral en la cámara. Es importante evitar tocar la médula espinal expuesta, las columnas dorsales o ejercer presión sobre ellas con los hilos más liker. Ahora, para teñir la mielina, detenga brevemente el flujo de solución y retire la línea de vacío.Agregue de cinco a 10 microlitros de tinte rojo Nilo de cinco milimolares cerca del extremo cordal de la médula espinal. A continuación, mezcle la solución suavemente por toda la cámara de imágenes y deje que el tejido se incube durante uno o dos minutos. Una vez teñido, devuelva el flujo de líquido cefalorraquídeo A oxigenado a entre 1,5 y dos mililitros por minuto y reemplace la línea de vacío con un fotomicroscopio de dos.Tome una imagen de la médula espinal con un objetivo de inmersión en agua. Baje lentamente el objetivo hasta la superficie del líquido cefalorraquídeo A y, a continuación, enfoque la médula espinal bajo la luz fluorescente de AF. Ahora cambie al modo de escaneo para obtener imágenes de referencia de la hierba ascendente.Fibras mielinizadas de Oculus. Para excitar el YFP y el rojo del Nilo, ajuste la excitación a 950 nanómetros y aísle las emisiones fluorescentes con filtros DI crónicos y de paso curvado. Si dentro de una hora de la imagen nota que más del 3% de los axones tienen esteroides, esto significa que la médula espinal ha sido dañada durante el aislamiento.Ahora es mejor descartar la preparación para dañar el tejido con el láser. Primero, ubique un área del tejido que parezca estar nivelada. A continuación, aumente la ampliación del área de visualización a 30,3 x.Ajuste el láser a 800 nanómetros y aumente su potencia a unos 110 milivatios. Ahora realice cinco escaneos láser de campo de visión. Los resultados deben ser una ablación completa de 20 micras de diámetro.Verifique la lesión con la configuración de imagen estándar con el láser a 17 milivatios y con un aumento de 20,08x. Si las fibras axonales en la ablación no están completamente seccionadas, deseche la preparación. Ahora, utilice los ajustes de lapso de tiempo con capturas Z para realizar grabaciones dinámicas de respuesta a lesiones.La preparación se puede visualizar hasta por 24 horas. Se aisló un segmento de la médula espinal y se colocó como se describe al inicio del estudio T-P-L-S-M. El registro muestra sajones articulares de hierba mielinizada como axones positivos YFP alineados paralelamente en mielina teñida con rojo dinar con vaina con pocos esteroides axonales u otros signos morfológicos de degeneración axonal.Se pueden ver detalles finos, como la nariz de ROM VA resaltada por puntas de flecha. 40 minutos después después de una lesión medular inducida por láser. La mayoría de los axones seccionados forman bulbos terminales axonales característicos y se retraen del sitio de la lesión, los axones adyacentes al sitio de la lesión sufren una degeneración secundaria y la hinchazón axonal se vuelve más prominente.A diferencia de las fibras retráctiles trimestrales, la mayoría de los bulbos del extremo axonal retráctil ubicados distalmente de la lesión y los esteroides estaban fuertemente marcados con rojo Nilo, lo que sugiere un cambio ambiental dentro del axón. A las siete horas, los axones continuaron retrayéndose lejos del sitio de la lesión. Sin embargo, esto es más evidente en los bulbos terminales localizados distal o rostral de la lesión que en los bulbos terminales localizados proximal o cordal a la lesión.En última instancia, los axones que inicialmente se salvaron sufrieron gradualmente una degeneración secundaria tardía. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar la médula espinal y neuro y realizar una lesión de la médula espinal inducida por láser. Por lo tanto, podrás examinar los aspectos dinámicos de la degeneración axonal primaria y secundaria en tiempo real.La información obtenida del uso de este sistema modelo puede conducir a una importante comprensión mecanicista del daño de los axones y la mielina después de una lesión.

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En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal En Vivo Imágenes de la médula espinal de ratón

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Introducimos un en vivo imagen método utilizando dos diferentes tintes fluorescentes para seguir la dinámicos cambios vasculares espinales tras una lesión contundente de la médula espinal en ratas Sprague-Dawley adultas.

Un en Vivo Dúo color método de proyección de imagen dinámica Vascular tras lesión medular contundente

Aquí, presentamos un protocolo usando Drosophila neurona sensorial - modelo de lesión de neurona arborización dendrítica (da), que combina en vivo en vivo la proyección de imagen, dos fotones láser axotomía/dendriotomy y potentes herramientas genéticas mosca, como una plataforma para la detección de potenciales promotores e inhibidores de Neurorregeneración.

Un modelo de lesión de Drosophila en Vivo para el estudio de Neurorregeneración en el periférico y sistema nervioso Central

La electroporación es un enfoque efectivo para entregar genes de interés en las células. Al aplicar este enfoque en vivo en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto (DRG), se describe un modelo para el estudio de la regeneración del axón en vivo.

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

La microcirculación de la médula espinal juega un papel fundamental en la lesión de la médula espinal. La mayoría de los métodos no permiten la evaluación en tiempo real de la microcirculación de la médula espinal, que es esencial para el desarrollo de terapias dirigidas a la microcirculación. Aquí, proponemos un protocolo utilizando sondas Laser-Doppler-Flow Needle en un modelo animal grande de isquemia / reperfusión.

Evaluación en tiempo real de la microperfusión de la médula espinal en un modelo porcino de isquemia/reperfusión

El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.

Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra

Aprende a evaluar la degeneración axonal aguda en tiempo real mediante microscopía de dos fotones en tejido espinal ex vivo. Este método permite visualizar dinámicas de lesiones axonales y de mielina con integridad tisular preservada.

Una Ex Vivo Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

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