Name: En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a enriquecer células iniciadoras del tumor de cáncer de ovario mediante cultivos en condiciones de baja adherencia y medio libre de suero. Este método utiliza citometría de flujo y modelos de xenoinjerto subcutáneo para verificar la tumorigenicidad y mejorar las estrategias terapéuticas contra esta enfermedad recurrente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos al Dr. John Risinger y al Memorial Health University Medical Center, Inc. por proporcionar generosamente la línea celular ACI-23. Los autores agradecen el apoyo financiero a través del Premio de Capacitación en Investigación Postdoctoral (PRAT) a C. House del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales.

1. Cultura de ovario líneas celulares de cáncer (adherentes Condiciones) NOTA: Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril <ol><li> Preparar medios de cultivo celular tradicional. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + 15 mM HEPES) y suplementar con suero fetal inactivado por calor al 10% de bovino y 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar la solución usando 0,45 micras filtro de vacío. </li><li> Preparar una tradicional poliestireno 75cm frasco de cultivo de tejido 2 etiquetada con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular de interest.Remove el vial de células de ultra baja congelador o nitrógeno líquido. Descongele colocando en baño a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Suspensión Traslado del vial en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 3 ml de medio de cultivo celular tradicional (preparado anteriormente). La suspensión se centrifuga a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. Mientras tanto, añadir 16 medios de cultivo celular tradicionales ml al matraz. </li><li>Aspirar el sobrenadante. El uso de 2 ml de cultivo celular células pipeta medios tradicionales hacia arriba y abajo para aflojar pellet y suspensión traslado al frasco. Suavemente frasco roca para distribuir uniformemente frasco cells.Place en humidificado incubadora de cultivo celular se establece en 37 ° C y 5% de CO 2. Monitorear las células diariamente hasta que se alcanzó el 80% de confluencia. </li><li> Una vez que las células son 80% confluentes dividió el cultivo 1: 2 en campana de cultivo celular. Aspirar el sobrenadante y lavar con solución salina tamponada con fosfato caliente (sin calcio y magnesio) (PBS). Añadir 1,5 ml de tripsina al 0,25% EDTA y se incuba 3-5 min a TA. </li><li> Prepare 2 nuevos 75cm 2 frascos de poliestireno y añadir 16 ml de medio de cultivo celular tradicional a cada matraz. Resuspender las células tratadas con tripsina en 4 ml de medios tradicionales de cultivo celular y alícuotas volúmenes iguales de cada uno de los nuevos matraces. </li><li> Colocar en frascos humidificado incubadora de cultivo celular ponen a 37 ° C y 5% de CO 2. Monitorear las células diariamente hasta que se alcanzó el 80% de confluencia. Continúe dividir celdas yla cultura o la congelación y almacenar a -80 o en nitrógeno líquido. </li></ol> 2. Generación de esferoides multicelulares de ovario líneas celulares de cáncer Uso de células flotantes o adherentes NOTA: Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril. Después de cultivar las líneas celulares bajo los métodos de cultivo tradicionales para 2-3 pasajes (sección 1) continuar con los siguientes pasos. <ol><li> Preparar los medios de comunicación de células madre. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + 15 mM HEPES) y suplementar con 1% de penicilina / estreptomicina (a una concentración final de 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina), 1% de reemplazo de suero knockout , 0,4% de albúmina de suero bovino y 0,1% de insulina-transferrina-selenio. Filtrar la solución usando 0,45 micras filtro de vacío. </li><li> Medios de células madre Suplemento con el factor recombinante humano de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (FGF) para una concentración final de 20 ng / ml y 10 ng / ml, respectivamente. NOTA: Los factores de crecimiento se deben agregar fresco a los medios de comunicación de células madre justo antes de su uso. </li><li> Crear cultura flotador TIC. Retire frasco de 80% de células confluentes cultivadas en condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Recoger medios de comunicación y todas las células flotantes (individuales y agregados), dejando a la población adherente detrás, y la transferencia a 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno. La suspensión se centrifuga a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. NOTA: Las células flotantes y agregados son evidentes 24-72 horas después de células adherentes se unen al matraz en la cultura tradicional. Desde un 80% de recuperación de la placa confluente de aproximadamente 1.0 - 5.0 x 10 5 células flotantes viables se puede esperar, dependiendo de la línea celular. En este estudio, el número medio de células flotantes recogidas de un cultivo adherente confluentes 80% fue: 5,0 x 10 5 para ACI-23, 4,8 x 10 5 para OVCAR5, 3,5 x 10 5 para Caov3, y 1,0 x 10 5 para TGS- 3. Tras la transferencia, multicelularla formación de esferoides ular en cultivo tradicional y TIC flotador se produce dentro de unos pocos días aunque esto es algo dependiente línea celular. Por ejemplo, ACI-23 células forman agregados más fácilmente que las células Caov3. </li><li> Mientras tanto, prepare un ultra bajo apego poliestireno superficie 75 cm 2 frasco de cultivo de tejido etiquetado con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular. Añadir 10 ml de células madre medios suplementados con factores de crecimiento al matraz. </li><li> Una vez que se completa la centrifugación, medios de aspirado y la transferencia de pellets a matraz bajo apego añadiendo 6 ml tallo medio celular y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para aflojar pellet. Colocar en frascos humidificado incubadora de cultivo celular ponen a 37 ° C y 5% de CO 2. Monitor de células cada 2 - 3 días para observar la formación de esferoides. </li><li> Crear cultura TIC tradicional. Retire frasco de 80% de células confluentes cultivadas en condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 1,5 ml de tripsina al 0,25% de EDTA y se incuba 3-5min a TA. </li><li> Preparar un ultra bajo apego poliestireno superficie 75 cm 2 frasco de cultivo de tejido etiquetado con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular. Añadir 10 ml de células madre medios de comunicación, suplementado con EGF y FGF, como se describe, al matraz. </li><li> Añadir 6 ml de medio de células madre en el matraz con la tripsina. Solución de células Pipetear hacia arriba y hacia abajo y tratar de aflojar las células de la superficie del matraz. Transfiera todo el volumen de las células a la ultra baja frasco adjunto que contiene los 10 ml provienen medio celular. Coloque el frasco en humidificado incubadora de cultivo celular establece en 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Suplemento culturas TIC cada 48 a 72 hr con un adicional de 2 ml detener los medios de comunicación celulares y EGF y FGF fresco para concentraciones finales de 20 ng / ml y 10 ng / ml, respectivamente. </li><li> Monitorear las células hasta 60 - se alcanza el 80% de confluencia. Culturas divididas por la colocación de volúmenes iguales en 2 frascos nuevos de ultra bajo de fijación y la adición de medios de células madre frescas para alcanzar un volumen final de 18 ml. AlternativaLy, centrífuga de toda la suspensión a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. Resuspender las células en medios de células madre complementados con EGF y FGF y distribuyen por igual en nuevos frascos de ultra bajo de apego. Las células no tienen que ser disociado en suspensiones de células individuales para pases. NOTA: En este punto, las culturas se seguirá dividiéndose y culta, congelado, o experimentalmente manipulado para su análisis. En 60 a 80% de confluencia se recuperaron las siguientes concentraciones de células de ACI-23: 8,0 x 10 6 para Tradicional Adherente, 4,0 x 10 6 para Tradicional TIC, y 5,0 x 10 6 de culturas Floater TIC. Aunque podría ser línea celular dependiente, hemos encontrado que de 5 - 10 días de cultivo es óptimo para el enriquecimiento TIC como el porcentaje de CD133 + ALDH + células es baja dentro de los primeros 3 días, los picos a los 5 - 10 días, y disminuye de nuevo en 14 días. </li></ol> 3. Generación de líneas de células epiteliales primarias de cáncer de ovario y multicelulares esferoidesde ascitis Paciente quimiorresistente NOTA: aprobación de la Junta de Revisión Institucional se obtuvo para este protocolo. Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril. <ol><li> Placa de fluido de ascitis 1: 1 con medio de cultivo celular tradicional. Preparar los medios de comunicación como se describe en la sección 1 y añadir 10 ml de varios frascos tradicionales cm2 de cultivo de tejidos de poliestireno 75. </li><li> El líquido ascítico se suele realizar en 1 L de botellas de vacío estéril; retire la tapa de vacío. Añadir con cuidado 10 ml de líquido ascítico al frasco que contiene 10 ml de medios de comunicación tradicionales y lugar en humidificado incubadora de cultivo celular establecidos a 37 ° C y 5% de CO 2. Deje reposar durante 72 a 96 horas, antes de hacer un cambio de medio completo. Cambie medios cada 2-3 días hasta que las células alcanzan 60-80% de confluencia </li><li> Una vez que las células alcanzan 60-80% de confluencia, dividir 1: 2 como se describe en el apartado 1. culturas Inicio TIC como se describe en la sección 2. NOTA: Los eritrocitos presentes en ascites serán removidos después del primer cambio de medio, ya que son no adherentes. Cualquier fibroblastos presentes serán eliminados en gran medida después del tratamiento con tripsina ya que son más sensibles y levantar con una exposición mínima a la tripsina. La pureza de las células de cáncer de ovario se determinó mediante análisis de citometría de flujo usando el anticuerpo de CA-125 (MUC16). </li></ol> 4. La tinción de células para Citometría de Flujo Confirmación de TIC Marcadores <ol><li> Reunir culturas TIC. Transferir contenido del frasco en 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno. Suspensiones Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 2 ml de solución de disociación celular no enzimática, incubar 3 - 5 min a 37 ° C, y pipetear arriba y abajo para romper los grumos y se disocian en células individuales. Añadir 4 ml detener los medios de comunicación celulares. </li><li> Recoger cultivos adherentes. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 3 ml de solución de disociación celular no enzimática y se incuba 3 - 5 min a 37 ° C. Añadir 3 ml de células tradicionalmedios de cultivo y pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las células del frasco y recogen en el tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugar tanto TIC y suspensiones adherentes durante 5 minutos a 400 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender cada sedimento en 1 ml de PBS que contenía suero bovino fetal al 3%. Incubar a RT 30 min. Mientras tanto, contar el número de células viables utilizando azul de tripano. Observar las células bajo el microscopio para confirmar esferoides se disocian en células individuales. </li><li> Etiqueta de 5 x 1,5 ml tubos Eppendorf para cada una de las siguientes condiciones de cultivo: 1) no teñida (control de mancha de indemnización), 2) ALDH (de control sola mancha positivo para la compensación), 3) CD133 (control positivo sola mancha de indemnización), 4 ) ALDH + CD133 (muestra experimental de prueba), y 5) DEAB + ALDH (controles negativos para la fluorescencia de fondo en FL-1 y FL-4 canales, respectivamente). </li><li> Distribuir aproximadamente 5 x 10 5 células cada uno de los tubos # 1 - 4. suspensiones Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Aspirar supernatant y volver a suspender las pastillas en 500 l Aldefluor tampón de ensayo. Añadir 10 l DEAB (inhibidor de ALDH) al tubo # 5 para el control negativo experimental. </li><li> Añadir 5 l activados reactivo Aldefluor al tubo # 2 para el control positivo de compensación y la película para mezclar. Añadir 5 l activados reactivo Aldefluor al tubo # 4 para el análisis experimental. Flick tubo para mezclar y transferir inmediatamente la mitad del volumen de células de tubo # 4 en el tubo # 5 (250 l) que contiene el DEAB. </li><li> Tubos Flick se mezclen bien. Incubar todos los tubos durante 30 - 45 min a 37 ° C protegido de la luz. Tubos Flick a mitad de período de incubación como células se depositan en el fondo. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 400 x g. Sobrenadante y volver a suspender las células Aspirar en 500 l Aldefluor tampón de ensayo. </li><li> Para tubos con tinción CD133 (# 3 y # 4), añadir CD133-APC 1:11 directamente en tampón de ensayo Aldefluor. Incubar 15 minutos en hielo protegido de la luz. Tubos de centrífuga de CD133 para 5 min a 400 x g. Lavar una vez con500 l Aldefluor tampón de ensayo. Resuspender las células en 500 l de tampón de ensayo Aldefluor, respectivamente. </li><li> Filtrar suspensiones en tubos de fondo redondo de poliestireno individuo con tapa filtro celular. Asegúrese de que todo el volumen se filtra a través de la tapa. </li><li> Utilizar un citómetro de flujo para analizar la población celular. Utilice tubos # 1-3 para ajustar los controles de compensación. Utilizando hacia adelante y los parámetros secundarios de dispersión, puerta de las células, asegurándose de excluir los desechos celulares. Establecer células dobles utilizando FL-1 y FL-4 canales, respectivamente ALDH + y CD133 +. </li><li> Utilizando un programa de análisis de citometría, confirman las condiciones de cultivo mejorado el porcentaje de células TIC como las culturas Tic-ricos deberían tener una mayor tinción para estos dos marcadores. NOTA: Además de CD133 y ALDH, otros TIC cáncer de ovario markersof se puede analizar con el número de marcadores usados ​​en cualquier muestra dependen de las capacidades de citómetro de flujo. </li></ol> 5. En vivo </em&gt; subcutáneos Inyecciones para confirmar Tumorigenicidad de poblaciones celulares NOTA: aprobación de la Junta de Revisión Institucional se obtuvo para este protocolo. Distribuir ratones desnudos hembra atímicos 6-8 semanas de edad en grupos experimentales en jaulas de 3 y permitir que se aclimaten durante unos días antes de las inyecciones. Siga ratones bajo directrices experimentales humanas como por NIH Cuidado de Animales y el empleo Comisión; controlar el peso corporal, la apariencia física, incluyendo la pérdida o ganancia de peso superior al 20%, aspecto demacrado, la diarrea o la dermatitis y la eutanasia a los ratones encajan estos criterios por CO 2 asfixia. <ol><li> Reunir culturas como se describe en la sección 2. Resuspender cada población celular en 1 ml de PBS. Contar las células viables mediante ensayo de azul tripán. </li><li> Preparar 15 ml tubos de centrífuga. Para triplicado medidas añaden 1,5 x 10 6 células viables diluidos en 2 ml de PBS en cada tubo (5 x 10 5 células en un volumen de 0,5 ml se inyectaron por vía subcutánea en la derecha flacio de cada ratón). Preparar 0,5 ml de PBS sólo para los ratones de control. </li><li> El uso de agujas 27 G, subcutaneouslyinject 0,5 ml de suspensión de células a partir de cultivos adherentes tradicionales, culturas TIC tradicionales, flotador culturas TiC, o PBS en el flanco derecho de cada uno de 3 ratones por grupo. Ratones Regreso al jaulas originales después de la inyección. </li><li> Pesar los ratones y medir cualquier tumores palpables en dos dimensiones dos veces weeklyby Vernier pinza, el establecimiento de longitud y anchura. NOTA: el tiempo de latencia del tumor es generalmente 20 a 50 días, dependiendo de la línea celular. </li><li> Calcular el volumen de tumor en húmedo por métodos estándar (V = (anchura) 2 x longitud / 2). NOTA: Aunque este estudio se comparó la tumorigenicidad de las TIC frente a las células adherentes de la primera generación sólo, pasada en serie en vivo de las TICs cultivadas bajo condiciones similares ha sido completado por otros 11,20. </li></ol>

<ol><li>Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latest+research+and+treatment+of+advanced-stage+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).</li>
<li>Ushijima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+for+recurrent+ovarian+cancer-at+first+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse.</a> J Oncol. 2010, 497429(2010).</li>
<li>Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+fallopian+tube+in+the+origin+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).</li>
<li>King, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ovulation+on+fallopian+tube+epithelial+cells%3A+evaluating+three+hypotheses+connecting+ovulation+and+serous+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Relat+Cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer.</a> Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).</li>
<li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495, 241-245 (2013).</li>
<li>Paik, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+epithelial+cells+are+concentrated+in+the+distal+end+of+the+fallopian+tube%3A+a+site+for+injury+and+serous+cancer+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation.</a> Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).</li>
<li>Connor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+A+contentious+hypothesis+now+moving+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward.</a> Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).</li>
<li>Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).</li>
<li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li>
<li>Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+stem-like+cells+from+a+human+ovarian+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line.</a> Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).</li>
<li>Kryczek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aldehyde+dehydrogenase+and+CD133+defines+ovarian+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.</a> Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).</li>
<li>Meng, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+ovarian+cancer+cells+demonstrate+cancer+stem+cell+properties+and+correlate+to+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival.</a> Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).</li>
<li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+human+ovarian+cancer+stem+cells+unravels+the+mechanisms+for+repair+and+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance.</a> Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+characteristics+of+CD44%2BCD117%2B+ovarian+cancer+stem+cells+in+three+dimensional+basement+membrane+extract+scaffold+versus+two+dimensional+monocultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures.</a> BMC Cell Biol. 14, 7(2013).</li>
<li>Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+CD133%2B+subpopulation+of+the+human+ovarian+cancer+cell+line+OVCAR3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3.</a> Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).</li>
<li>Curley, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+expression+defines+a+tumor+initiating+cell+population+in+primary+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer.</a> Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CD133+and+tumorigenicity+of+CD133%2B+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells.</a> Oncogene. 28, 209-218 (2009).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroid+cells+with+stem+cell-like+properties+contribute+to+tumor+generation%2C+metastasis+and+chemotherapy+resistance+through+hypoxia-resistant+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism.</a> PLoS One. 9, e84941(2014).</li>
<li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).</li>
<li>Jaggupilli, A., Elkord, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD44+and+CD24+as+cancer+stem+cell+markers%3A+an+enduring+ambiguity%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 708036(2012).</li>
<li>Irollo, E., Pirozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%3A+to+be+or+not+to+be%2C+is+this+the+real+question%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">CD133: to be or not to be, is this the real question.</a> Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).</li>
<li>Ma, I., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).</li>
<li>McLean, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma%E2%80%93associated+mesenchymal+stem+cells+regulate+cancer+stem+cells+and+tumorigenesis+via+altered+BMP+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production.</a> J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).</li>
<li>Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+cellular+vehicles+for+prodrug+gene+therapy+against+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors.</a> Biochimie. , (2014).</li>
<li>Brabletz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+MET+in+metastasis%3A+where+are+the+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).</li>
<li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients%3A+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, e46858(2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).</li>
<li>Malecki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRA-1-60%28%2B%29%2C+SSEA-4%28%2B%29%2C+Oct4A%28%2B%29%2C+Nanog%28%2B%29+Clones+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+the+Embryonal+Carcinomas+of+the+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries.</a> J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).</li>
<li>Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).</li>
<li>Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-initiating+stem-like+cells+in+human+prostate+cancer+exhibit+increased+NF-%CE%BAB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling.</a> Nat Commun. 2, 162(2011).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oct4+and+Nanog+transcription+network+regulates+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 38, 431-440 (2006).</li>
<li>Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+to+Nanog%2C+Oct4+and+Sox2+coding+regions+modulate+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation.</a> Nature. 455, 1124-1128 (2008).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+impact+of+the+cancer+stem+cell-related+marker+NANOG+in+ovarian+serous+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma.</a> Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí presenta un método eficiente y consistente para enriquecer cultivos de células con características de células madre a partir de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y es aplicable a muestras primarias de pacientes. Este método enriquece con éxito para los tics a través de una variedad de líneas celulares. Permite la identificación oportuna de las condiciones que enriquecen a un TIC y / o fenotipo tumorigénico, sin tomarse el tiempo para ordenar físicamente las TICs de los no TICs dentro de la población. De esta manera, los niveles relativos de las diferentes vías de señalización pueden ser evaluados por su contribución al fenotipo TIC mediante la comparación de cultivos adherentes tradicionales para Tic culturas que utilizan una variedad de ensayos funcionales. Si se desea una población pura TIC, el aislamiento se puede conseguir fácilmente mediante la incorporación de un paso de fluorescencia asistida o magnético de clasificación en el protocolo de citometría de flujo. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que la expresión del marcador de TICs, tales como CD133, CD44, o ALDH, puede variar entre líneas celulares o muestras incluso del mismo tipo de tumor de pacientes. Por ejemplo encontramos que las células OVCAR-5 tienen una mayor expresión de CD44 en relación con CD133, mientras que lo contrario es cierto para ACI-23. Por tanto, es pertinente que confiar en la iniciación del tumor en ratones y análisis de citometría de flujo como definitiva de la presencia TIC. Siguiendo este protocolo, actividad alta ALDH fue constantemente observada cuando las células de cáncer de ovario se cultivaron en condiciones de células madre. Curiosamente, la expresión CD133 es consistentemente mayor en las células de ACI-23 cultivadas en condiciones tradicionales de cultivo de TIC, mientras que ALDH es mayor en flotador condiciones TIC. En contraste los TGS-3 células de ascitis primarios muestran un pequeño aumento en CD133 positividad bajo condiciones flotador TIC, pero un aumento notable en la actividad ALDH en condiciones TIC tradicionales. Estos resultados ponen de manifiesto la heterogeneidad de las células del cáncer de ovario y la plasticidad comúnmente asociado con las TICs. Para apoyar aún más la claim que estos métodos mejoran TIC, también se observó el enriquecimiento de TRA-1-60 células positivas. TRA-1-60 es un marcador de pluripotencia y se ha utilizado para identificar carcinomas embrionarios del ovario y testículos, así como cáncer de próstata TICS 30-32. Aunque nuestros métodos han tenido éxito con numerosas líneas de células, es posible que las condiciones TIC estándar pueden ser más adecuado para algunas células de cáncer de ovario, mientras que las condiciones flotador modificados mejor enriquecen para los tics en otras poblaciones de células de cáncer de ovario. De nuevo, esto pone de manifiesto la heterogeneidad esperada dentro de las dos líneas celulares de cáncer de ovario-derivados de pacientes y establecidos. Además de los marcadores de superficie celular hay varios factores de transcripción que se ha demostrado para caracterizar TIC cáncer de ovario incluyendo Nanog, Sox2, Oct-4 11, aunque estos marcadores no son específicos de TIC de cáncer de ovario y más bien representan factores importantes para la pluripotencia de células madre embrionarias y difdiferencia- 33,34. Se examinaron los cambios en los niveles proteicos de estos factores y encontró que los niveles Nanog aumentan en condiciones de cultivo de TIC, de acuerdo con los demás 13,35 así como CD133, TRA-1-60, y CD117. Una matriz de ADNc marcador de células madre humanas mostró además un incremento en los genes CD133, Nanog, Melk y Podxl en las condiciones TIC en comparación con las condiciones adherentes tradicionales. Es importante destacar que, cabe señalar que, como con marcadores de superficie celular, factores de transcripción asociados con tics ováricos pueden variar entre líneas celulares y muestras de pacientes. Hemos observado que las células pueden ser más tumorigénico y expresan niveles más altos de marcadores de células madre si son inherentemente no adherente in vitro (es decir, células que no se adhieren fácilmente a una placa adherente flotante). En cultivo, líneas celulares tales como ACI-23 normalmente tienen muchas células y / o células viables flotantes que crecen verticalmente en una manera de apilamiento bajo Condit cultura tradicionaliones. Aunque el enriquecimiento exitosa de TICs de las células flotantes y agregados podría ser líneas celulares aplicables a relativamente pocos incluidas las del presente estudio y OVCAR-3 12, nuestros hallazgos sugieren que esto podría representar una población más tumorigénico. Por lo tanto, la recolección de la población &quot;flotante&quot; de las células cultivadas en placas de cultivo de tejidos y medios de comunicación estándar puede servir como un método alternativo de enriquecimiento de TIC, para las células que se adaptan mal a los medios de comunicación de células madre comercial. El uso de los diferentes métodos de cultivo que se presentan en este manuscrito permitirá el enriquecimiento rápido de las poblaciones de TIC y una mejor comprensión de cuáles son los factores apoyar este fenotipo en diferentes células. Las aplicaciones actuales de este método incluyen caracterizadora que las vías de señalización son vitales para mantener la propagación de esta población única de células. Los resultados de estos estudios ayudarán a aclarar los mecanismos de progresión del tumor y la recaída.

El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal en los Estados Unidos con la mayor causa de morbilidad y mortalidad de ser las características altamente recurrentes, quimiorresistentes de esta enfermedad. El tratamiento primario por lo general comprende la cirugía de citorreducción máxima y la terapia basada en platino posterior, aunque existe cierta evidencia que sugiere la terapia neoadyuvante podría ser beneficioso en algunos casos 1. La mayoría de los pacientes responden favorablemente al tratamiento primario, pero desafortunadamente la mitad recaerá en 18 meses 2. La mayoría de los tumores malignos de ovario son carcinomas epiteliales y pueden tener su origen en el epitelio superficial del ovario o 3,4 tubo de Falopio. Varios estudios apoyan la existencia de células madre somáticas en el sistema reproductor femenino que, presumiblemente, ayudar en la reparación de los tejidos que se necesita después de la ovulación 5,6. La alta actividad proliferativa, tanto en el ovario y la trompa de Falopio durante ovulación podría ser un factor importante en el desarrollo de cáncer de ovario (Gharwan, et al. manuscrito presentado). La derivación de las células tumorales de formación está claro pero puede surgir a partir de células madre normales, células progenitoras, o células diferenciadas a través de mutaciones que las hacen incapaces de regular la división o el destino. Estas células también se han denominado &quot;células madre del cáncer&quot;, o &quot;células iniciadoras del cáncer&quot;, y pueden crecer en esferoides multicelulares tumorígenos, bajo condiciones de poca fijación. Aunque el modelo jerárquico de desarrollo TIC puede ser dinámico, TICs comparten muchas de las mismas características que las células madre normales, incluyendo la quietud, la resistencia a la quimioterapia, a largo plazo la auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en varios linajes celulares 7,8. Varios estudios apoyan la existencia de las TICs en el cáncer de ovario y de los esfuerzos actuales están llevando a cabo para aclarar el mecanismo (s) por el cual estas células apoyan tumorigénesis 9-11. Se han propuesto varios marcadores para identificar TIC de ovario con tumorigenicidad mejorada incluyendo CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, y MyD88, aunque la contribución exacta de cada marcador no está clara y puede ser de tipo celular específico 11-16. Mientras que un marcador universal, o conjunto de marcadores no se ha demostrado de manera inequívoca para TICs ováricos, diferentes grupos han aislado TICs ováricos más comúnmente mediante la selección de CD44 +, CD133 + y / o células con alta aldehído deshidrogenasa (ALDH) actividad 13,17-21. CD44 es una glicoproteína transmembrana que actúa como receptor para el ácido hialurónico y regula varios procesos importantes para la progresión tumoral, incluyendo la adhesión, proliferación, migración, la angiogénesis y la diferenciación 22. CD133 es una glicoproteína transmembrana cuya función todavía no está claro, pero los estudios sugieren que organiza topología de la membrana plasmática 23. ALDH, una enzima intracelular que cataliza la oxidación de aldehídos, puede ser la más universal marcador de TIC como alta actividad ha sido identificada en células madre aisladas de una variedad de tejidos y múltiples funciones han sido atribuidas a ALDH en el apoyo a las células madre normales y los tics 24. A partir de ahora, CD133 y ALDH1 parecen ser los marcadores más reproducibles de TICs ovario 13,21. Además de conocer las características de las TICs, también hay un gran esfuerzo para identificar fármacos que se dirigen específicamente a esta subpoblación. La alta tasa de recaída asociado con el cáncer de ovario puede ser debido al fracaso de las quimioterapias actuales para erradicar con éxito tics. Aunque la mayor parte del tumor es susceptible a las terapias existentes, tics se cree que son resistentes y con una densidad indetectable por métodos estándar. Elucidar los mecanismos de resistencia a la terapia y la recaída del tumor son vitales para mejorar la respuesta y las tasas de supervivencia global de los pacientes con cáncer de ovario. Aquí, las técnicas de cultivo se describen ésimoa enriquecer para los tics de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y primarios. Las condiciones de cultivo descritas en el presente documento se han usado por varios grupos para inducir la propagación de células tics o esferoide con cualidades de células madre 11,12,14,16,20. Aunque hay varios medios de cultivo de células madre y suplementos comúnmente usados ​​para enriquecer TIC / esferoides se utilizó una fórmula medios libres de suero con EGF y FGF, pero sin la adición de B27 o N-2 suplementos. Estos suplementos, comúnmente utilizados para el cultivo celular neuronal y enriquecedora para las células madre, se han demostrado para promover un fenotipo mesenquimal 25,26 y hay cierta incertidumbre en el campo de si TIC que tienen un fenotipo mesenquimal o epiteliales son más tumorigénico 27-29 . Para minimizar las incertidumbres y las variables se optó por utilizar la fórmula más común, ya que se trata de células de cáncer de ovario epitelial. El mantenimiento de las células en medio libre de suero en un matraz bajo adjuntofacilita la formación de esferoides y apoya la propagación de células con expresión CD133 y alta actividad ALDH. Nuestro trabajo ha puesto de manifiesto, además, que las células flotantes en condiciones normales adherentes también pueden representar una población TIC más tumorigénico. La inyección de células cultivadas en estas condiciones en ratones desnudos atímicos conduce a un mayor potencial tumorigénico en comparación con las células cultivadas en condiciones adjuntas en presencia de suero. Mucha información sobre el papel de las TICs en la iniciación del cáncer ovárico, la progresión, la respuesta terapéutica, y la recaída de la enfermedad puede ser adquirida a través de la utilización de estas técnicas.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 matraz de fijación ultra baja</td><td>Corning</td><td>3814</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 matraz para cultivo de tejidos</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.002</td><td></td></tr><tr><td>Aldefluor Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD133-APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-090-826</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos - Recombinante humano básico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Preparado según las instrucciones del fabricante</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico - humano recombinante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Preparado por disolución de 0,2 mg con 1 ml de PBS estéril</td></tr><tr><td>DMEM:F12 (+L-glutamina, +5 mM HEPES)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (sin calcio ni magnesio)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Cellstripper Solución de disociación celular no enzimática</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Suero KnockOut de Reemplazo</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (inactivado por calor)</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Esterilizables Estériles de Flujo Rápido con Membrana CN (0.45 &mu; m)</td><td>Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubo de centrífuga de polipropileno estéril</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo cónico de polipropileno estéril</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano solución al 0,4% en NaCl al 0,85%</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr></tbody></table>

en enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

La evidencia sugiere que pequeñas subpoblaciones de células tumorales mantienen una capacidad única de autorrenovación y diferenciación y pueden ser responsables de la iniciación y/o recaída del tumor. Esclarecer los mecanismos por los cuales estas células iniciadoras de tumores (TIC) apoyan la formación y progresión del tumor podría conducir al desarrollo de terapias clínicamente favorables. El cáncer de ovario es una enfermedad heterogénea y muy recurrente. Estudios recientes sugieren que las TIC pueden desempeñar un papel importante en la biología de las enfermedades. Hemos identificado condiciones de cultivo que enriquecen las TIC de las líneas celulares de cáncer de ovario. El crecimiento de células adherentes o células "flotantes" no adherentes en una placa de baja adherencia con medios libres de suero en presencia de factores de crecimiento apoya la propagación de TICs de cáncer de ovario con marcadores de células madre (actividad de CD133 y ALDH) y el aumento de la tumorigénesis sin la necesidad de separar físicamente las TICs de otros tipos de células dentro del cultivo. Aunque la presencia de células flotantes no es común para todas las líneas celulares, esta población de células con baja adherencia innata puede tener un alto potencial tumorigénico. En comparación con las células adherentes cultivadas en presencia de suero, las TIC forman fácilmente esferas, son significativamente más tumorigénicas en ratones y expresan marcadores putativos de células madre. Las condiciones son fáciles de establecer de manera oportuna y se pueden utilizar para estudiar las vías de señalización importantes para mantener las características del tallo, y para identificar fármacos o combinaciones de fármacos dirigidos a las TIC. Las condiciones de cultivo descritas en este documento son aplicables para una variedad de células de cáncer de ovario de origen epitelial y serán fundamentales para proporcionar nueva información sobre la función de las TIC en la iniciación, progresión y recaída del tumor.

Establecido líneas celulares de cáncer de ovario y una línea celular de ascitis primaria cultivada en condiciones de cultivo tradicionales adherentes en la presencia de suero espectáculo adjunta, la morfología de adoquines, mientras que las mismas células cultivadas en condiciones de cultivo TIC pantalla flotante morfología esferoidal, común en las poblaciones de TIC. Imágenes de campo claro mostradas en la Figura 1 A muestran claramente las diferencias morfológicas en las condiciones de cultivo. La Figura 1B muestra las morfologías diferenciadas obtenidos después de resiembra las ACI-23 y TGS-3 culturas TIC en condiciones adherentes tradicionales. Sólo 24 hr después de la siembra de nuevo en condiciones adherentes, la mayoría de los esferoides multicelulares se disocian y se adhieren a la superficie, se asemeja a las células adherentes típicas. Para verificar que las condiciones TIC enriquecen de células con marcadores de células madre de citometría de flujo se realizó un análisis utilizando dos marcadores comunes de TICs de ovario - CD133 expression y la actividad de ALDH. Las gráficas de puntos que se muestran en la Figura 2 A resaltar el aumento del porcentaje de células CD133 + en poco apego, condiciones libres de suero. Del mismo modo, la actividad de la enzima ALDH es mayor en estas condiciones en comparación con condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Aunque los cultivos adherentes tradicionales contienen células CD133 +, los incrementos porcentuales en condiciones que mejoran la formación de esferoides. Análisis de un marcador de pluripotencia, TRA-1-60, se presta más apoyo que las condiciones TIC enriquecen de TICs, Figura 2 B. La cuantificación de la Figura 2 C demuestra que (CD133 + ALDH +) ACI-23 células doble positivas se limitan en gran parte a los cultivos que crecen bajo condiciones que mejoran TIC. También se examinaron los cambios en los niveles de proteína de diferentes factores de transcripción que se producen en las células de ACI-23 después de cinco días de cultivo en las condiciones TIC. Un aumento progresivo de cada uno de el marcadors se ve desde lo tradicional a flotador condiciones TIC en comparación con los niveles relativamente bajos observados en el cultivo adherente, Figura 2 D. Curiosamente una línea celular humana ascitis crecido en las diversas condiciones muestra el fenotipo marcador más alto que las condiciones TIC tradicionales con poca o ninguna tinción presente en las condiciones TIC flotador, la Figura 2 E. La tumorigenicidad de las condiciones de cultivo TIC se validó a través de inyecciones subcutáneas de números iguales de células viables obtenidas a partir de todas las condiciones en cohortes de ratones desnudos atímicos. La Figura 3 demuestra que ACI-23 (A, B) y OVCAR-5 (C) células de cultivos adherentes tradicionales fueron menos tumorigénicas que los de las culturas TIC. Tenga en cuenta que las culturas TIC flotantes producen tumores más grandes en un período corto de tiempo que las culturas tradicionales TIC adherentes o tradicionales. Estos data sugieren que incluso con un modesto aumento en los marcadores de TIC de ovario, hay un cambio fenotípico dramático. Sin embargo, con otras líneas celulares (no se muestra) las culturas TIC tradicionales eran más tumorigénico de las células del cultivo TIC adherentes y flotador tradicionales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> Figura 1. Esferoide de desarrollo en diferentes condiciones de cultivo. (A) de la empresa de ovario líneas celulares de cáncer de células primarias derivadas del paciente ascitis (TGS-3) obtenidas en matraces de fijación con bajos libre de suero (ACI-23, OVCAR-5 y Caov3) y tallo medio celular forma fácilmente esferoides multicelulares. Las imágenes muestran las condiciones de cultivo adherentes tradicionales mantienen la morfología de adoquines epitelial en ACI-23, OVCAR-5, Caov3 y TGS-3 células, mientras que las mismas células formadas esferoides dentro de las 96 horas en condiciones de TIC. Barra de escala 100 micras. (B) Tras la exposición de 24 horasa condiciones de cultivo adherentes tradicionales, las morfologías de cultivo TIC muestran un fenotipo diferenciado se asemeja a la morfología original de adherente. Barra de escala 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> Figura 2. Baja-apego, condiciones libres de suero para enriquecer células con marcadores de TIC. (A) análisis de citometría de células ACI-23 utilizando APC conjugado anticuerpo CD133 flujo demuestra un aumento del porcentaje de células CD133 + en frascos bajos de apego con tallo sin suero medios de comunicación celulares. Utilizando análisis de citometría de flujo muestra de ensayo Aldefluor aumento de la actividad ALDH en células cultivadas en matraces bajas de fijación con los medios de células madre libre de suero. Control negativo CD133 no contiene anticuerpos y con negativo ALDHcontrol es el sustrato activado en presencia del inhibidor de ALDH (DEAB). (B) Análisis utilizando FITC conjugado anticuerpo TRA-1-60 muestra mayor porcentaje de células TRA-1-60 + en los flotadores condiciones TIC en ACI-23 células. El control negativo no contiene anticuerpo. (C) CD133 + ALDH + células son las más altas en el tradicional TIC y flotador condiciones TIC en la línea celular de ACI-23. Las barras de error: SEM, n = 6, * p &lt;0,05. (D) Análisis de transferencia de Western que muestra aumento en los niveles de proteína de marcadores transcripcionales de las células madre en las células ACI-23 cultivadas en condiciones TIC durante 5 días. Lisados ​​de células enteras (50 g) se analizaron con GAPDH como control de carga. (E) gráficos de puntos representativos de TGS-3 células de ascitis primarios analizados como en A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Low-apego, condiciones libres de suero enriquecen para las células con un aumento de la tumorigenicidad. (A) 5 x 10 5 ACI-23 células viables se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos por triplicado. Los ratones se pesaron y se midieron los tumores mediante un calibre dos veces por semana. A = cultura tradicional adherente, cultura F = Flotante TIC, la cultura S = tradicional TIC. * P &lt;0,05. (B) Imágenes representativas de los tumores formados a partir de ACI-23 después de 25 días usando células cultivadas bajo diferentes condiciones de cultivo. (C) 5 x 10 5 células viables OVCAR-5 se inyecta por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos por triplicado y monitoreado como en A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las células iniciadoras de tumores (TICs) pueden representar una diana terapéutica viable para el tratamiento del cáncer de ovario, una enfermedad altamente recurrente y mortal. Presentamos un protocolo para condiciones de cultivo enriquecedoras para esta población de células altamente tumorigénicas.

En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar las condiciones de cultivo que más favorezcan el enriquecimiento de células iniciadoras de tumores de cáncer de ovario. Esto se logra primero transfiriendo las células de interés a frascos con baja adherencia en medio para células madre libre de suero y que contiene factores de crecimiento. Como segundo paso, se realiza citometría de flujo para evaluar la expresión de CD133 y la actividad de ALDH de las células.A continuación, las células de los cultivos que presentan un enriquecimiento más alto en marcadores de células iniciadoras de tumores se inyectan por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos para verificar la genicidad tumoral de los cultivos. En última instancia, la citometría de flujo y los modelos de xenoinjertos subcutáneos pueden utilizarse para determinar las condiciones de cultivo que inducen el mayor porcentaje de células iniciadoras de tumores de cáncer de ovario. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que algunas de nuestras líneas celulares presentaban características de crecimiento inusuales y parecían prosperar como cúmulos libres en suspensión, un fenotipo que probablemente se asemeja a lo que ocurre in vivo en pacientes con cáncer de ovario.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer de ovario, ya que existe una alta tasa de enfermedad recurrente resistente a la quimioterapia en el cáncer de ovario, y muchas evidencias sugieren que las células iniciadoras de tumores contribuyen a este fenómeno. Para generar un cultivo de células iniciadoras de tumores en suspensión, primero transfiera las células flotantes de un cultivo celular al 80 % de confluencia a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros mientras las células se sedimentan por centrifugación. A continuación, añada 10 mililitros de medio para células madre suplementado con factores de crecimiento a un frasco de cultivo de tejidos de poliestireno con superficie de adherencia ultrabaja de 75 centímetros cuadrados, etiquetado con el nombre, la fecha y el número de pase de la línea celular. Luego aspire el sobrenadante del tubo cónico y resuspenda el precipitado en seis mililitros de medio para células madre.Transfiera las células al matraz y colóquelas en un incubador de cultivo celular humedecido ajustado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, monitoreando las células cada dos o tres días para observar la formación de esteroides y crear un cultivo tradicional de células iniciadoras de tumor. Descarte las células flotantes de un cultivo celular con 80% de confluencia y lave las células adherentes con PBS tibio. A continuación, separe las células con 1,5 mililitros de una solución de tripsina-EDTA a temperatura ambiente.Después de tres a cinco minutos, detenga la reacción con seis mililitros de medio para células madre y triture la solución celular varias veces para soltar las células de la superficie del matraz. Transfiera las células disociadas a un matraz de cultivo de tejidos de poliestireno con superficie ultra baja de adherencia de 75 centímetros cuadrados que contenga 10 mililitros de medio para células madre, suplementado con factores de crecimiento. Luego, coloque el matraz en el incubador de cultivo celular y suplemente las células cada 48 a 72 horas con dos mililitros adicionales de medio para células madre y factores de crecimiento frescos.Monitoree el cultivo tradicional de células iniciadoras de tumores hasta que se alcance una confluencia del 60 al 80 %. Luego, divida el cultivo transfiriendo volúmenes iguales del sobrenadante a dos nuevos frascos de adherencia ultrabaja e incorpore medio fresco para células madre suficiente para obtener un volumen final de 18 mililitros, con el fin de generar cultivos esteroideos multicelulares a partir de ascitis de pacientes resistentes a la quimioterapia. Comience retirando la tapa de un frasco estéril de vacío de un litro que contenga líquido de ascitis y transfiera 10 mililitros de la ascitis a un matraz de cultivo tisular de 75 centímetros cuadrados de poliestireno que contenga 10 mililitros de medio tradicional.Coloque el matraz en el incubador de cultivo celular durante 72 a 96 horas y luego realice el primer cambio completo de medio cuando las células alcancen una confluencia del 60 al 80 %. Divida el cultivo de uno a dos, como se acaba de demostrar, para usarlo como cultivos iniciadores de tumores y permanecer en las células para el análisis citométrico de flujo. Comience etiquetando cinco tubos de 1,5 mililitros para cada una de las condiciones de cultivo que aparecen en la tabla. A continuación, distribuya aproximadamente 500.000 células en cada uno de los tubos uno a cuatro.Luego, centrifugar las células, resuspender los precipitados en 500 microlitros de tampón de ensayo al Fluor y añadir 10 microlitros de DEAB, un inhibidor de LDH, al tubo número cinco. Para el control negativo experimental, añadir 5 microlitros del reactivo al theor activado a los tubos dos y cuatro, agitando suavemente cada tubo para mezclar. A continuación, transferir inmediatamente la mitad del volumen de las células del tubo cuatro al tubo cinco, mezclar el tubo cinco agitándolo suavemente también, e incubar todos los tubos durante 30 a 45 minutos a 37 grados Celsius, protegidos de la luz.Al final del período de incubación, centrifugar todos los tubos y resuspender los pellet en 500 microlitros de tampón de ensayo alor. A continuación, añadir CD 1 33 A PC a los tubos tres y cuatro e incubar los tubos en hielo protegidos de la luz. Tras 15 minutos, centrifugar las células dos veces y resuspender los pellet en 500 microlitros de tampón de ensayo alor.Luego, filtre todas las suspensiones celulares a través de tubos individuales de fondo redondo de poliestireno con tapas de malla para células. Asegúrese de que todo el volumen pase a través de la tapa y luego use los tubos uno a tres para ajustar los controles de compensación en el citómetro de flujo, seleccionando las células mediante los parámetros de dispersión directa y lateral, teniendo cuidado de excluir los restos celulares.Utilice los canales FL uno y FL cuatro para identificar las células doblemente positivas para A LDH y CD 1 33, respectivamente, y luego analice las células. Las culturas ricas en células iniciadoras de tumores mostrarán un mayor nivel de tinción para los marcadores de superficie celular A LDH y CD 1 33 en comparación con las culturas de células no iniciadoras de tumores. Para confirmar la tumorigenicidad de las células iniciadoras de tumores, primero recoja las células de las culturas multicasulares de OID tal como se acaba de demostrar.Re-suspender cada población celular en un mililitro de PBS y luego determinar el número de células viables mediante exclusión con azul de tripano. A continuación, añadir 1.500.000 células diluidas en dos mililitros de PBS en cada uno de tres tubos cónicos de 15 mililitros por tumor, iniciando así la condición de cultivo celular. Luego, utilizando agujas de calibre 27, inyectar 0,5 mililitros de células procedentes de cultivos adherentes tradicionales, cultivos de CTC tradicionales flotantes, cultivos de CTC o solo PBS, por vía subcutánea en el flanco derecho de cada uno de tres ratones por grupo, y devolver cada ratón a su jaula original tras la inyección.Finalmente, pese a los animales y mida los tumores palpables en dos dimensiones dos veces por semana mediante calibrador vernier para determinar la longitud y el ancho de los tumores, como se muestra en estos gráficos de puntos. Un mayor porcentaje de células positivas para CD133, junto con una mayor evidencia de actividad enzimática de ALDH y condiciones de cultivo libre de suero con baja adhesión en comparación con los cultivos adherentes tradicionales, indica una población enriquecida de células iniciadoras de tumores en los cultivos esteroides multicelulares. Aunque los cultivos adherentes tradicionales contienen células positivas para CD133, el porcentaje aumenta en condiciones que favorecen el análisis de la formación de OID y del marcador de pluripotencia.El dibujo de un 60 confirma además que las condiciones de cultivo para células iniciadoras de tumores, ricas en células iniciadoras de tumores, en efecto limitan en gran medida las células CD133ALDH doble positivas a CI123 a cultivos crecidos bajo condiciones que favorecen las células iniciadoras de tumores, y se observa un aumento progresivo en cada uno de estos diferentes factores de transcripción al pasar de las condiciones tradicionales a las condiciones de células iniciadoras de tumores en flotación, en comparación con los niveles relativamente bajos evidentes en el cultivo adherente. Finalmente, como se esperaba, las células CI125 y OVR5 procedentes de cultivos adherentes tradicionales mostraron ser menos tumorogénicas que aquellas procedentes de los cultivos de células iniciadoras de tumores. Más aún, los cultivos de células iniciadoras de tumores en flotación produjeron tumores más grandes en un período de tiempo más corto que los cultivos tradicionales adherentes o los cultivos tradicionales de células iniciadoras de tumores considerados conjuntamente.Estos datos sugieren que incluso con un aumento moderado en los marcadores de células iniciadoras de tumores ováricos, existe un cambio fenotípico dramático en los cultivos enriquecidos con células iniciadoras de tumores. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear y reponer las células con medio fresco y factores de crecimiento. Cada dos o tres días, un período de cultivo demasiado corto no proporcionará tiempo suficiente para el enriquecimiento, mientras que uno demasiado largo puede provocar la diferenciación de las células y una consiguiente pérdida de sus marcadores en la tumorigenicidad.

in-vitro-enrichment-of-ovarian-cancer-tumor-initiating-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El ensayo de depuración mesotelial se describe aquí se aprovecha de las células de la etiqueta fluorescente y time-lapse microscopía de vídeo para visualizar y medir cuantitativamente las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales. Este ensayo permite simular las primeras etapas de la metástasis del cáncer de ovario.

Ensayo in vitro Liquidación mesoteliales que modela los pasos iniciales de la metástasis del cáncer ovárico

Se describen las metodologías para el establecimiento...

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

En este video, describimos un método para aislar y caracterizar células de cáncer de ovario primario a partir de muestras sólidas de tejido tumoral de ovario. Las células epiteliales de cáncer obtenidas mediante este protocolo son adecuadas para comprender los procesos que pueden conducir a la iniciación y el desarrollo del cáncer de ovario.

Obtención de células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas: un método para cultivar células epiteliales de cáncer de ovario a partir de muestras de tumores de ovario

Este estudio describe un método detallado para el aislamiento y caracterización de células de cáncer de ovario primarios de muestras clínicas sólidos. Especímenes clínicos sobre el cáncer de ovario son sometidas a digestión enzimática para obtener, fibroblastos-epitelial libre de cáncer de ovario de células viables (EOC) muy adecuada para aplicaciones posteriores.

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Describimos una plataforma de imágenes animales no invasiva que permite la detección, cuantificación y seguimiento del crecimiento y la recurrencia del cáncer de ovario. Este modelo de xenoinjerto intraperitoneal imita el perfil clínico de las pacientes con cáncer de ovario.

Modelo murino de imagen no invasivas para detectar y vigilar cáncer ovárico de Recurrencia

Las células madre del cáncer (CSC) están implicados en la recidiva del tumor debido a la quimio-resistencia. Hemos optimizado un protocolo para la selección y expansión de células madre cancerosas de líneas celulares de cáncer de ovario. Mediante el tratamiento de las células con el cisplatino quimioterapia y cultivar en una célula madre promoción de los medios de comunicación que enriquecen las culturas CSC no adherentes.

El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

Los ensayos de esferas in vitro se utilizan comúnmente para identificar células madre cancerosas. Aquí comparamos ensayos de esferas individuales con ensayos basados en múltiples células. Los ensayos más laboriosos basados en células individuales o la suplementación con metilcelulosa dan resultados más precisos, mientras que los ensayos basados en células múltiples realizados en medio líquido pueden verse muy influenciados por la densidad celular.

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Para aclarar el proceso de múltiples etapas de diseminación peritoneal de carcinoma de ovario, el estudio actual presenta un modelo experimental murino de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal a través de la inoculación ortotópico con estas células tumorales.

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal<em&gt; vía</em&gt; Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario

Las células madre del cáncer de ovario (OCSC) son responsables de la iniciación, recurrencia, resistencia terapéutica y metástasis del cáncer. Se considera que el nicho vascular OCSC promueve la autorrenovación de las OCSC, lo que lleva a la quimiorresistencia. Este protocolo proporciona la base para establecer un modelo de nicho vascular OCSC reproducible in vitro.

Evaluación de las propiedades angiogenéticas de las células madre similares al cáncer de ovario utilizando el sistema de cocultivo tridimensional, NICO-1

Presentamos un protocolo que se puede utilizar para realizar pruebas terapéuticas de fármacos con organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes.

Modelos de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario para pruebas preclínicas de medicamentos

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.

Un modelo ex vivo de metástasis peritoneal de cáncer de ovario con epiplón humano

Aprende a enriquecer células iniciadoras del tumor de cáncer de ovario mediante cultivos en condiciones de baja adherencia y medio libre de suero. Este método utiliza citometría de flujo y modelos de xenoinjerto subcutáneo para verificar la tumorigenicidad y mejorar las estrategias terapéuticas contra esta enfermedad recurrente.

En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

Explorar más videos