Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

El objetivo general de este procedimiento es hacer crecer ovarios neonatales y/o folículos ováricos individuales in vitro. Esto se logra diseccionando primero los ovarios de hembras frías de la edad adecuada. El segundo paso es preparar el tejido, incluida la disección fina de los folículos ováricos individuales con agujas de acupuntura.

A continuación, se cultivan los ovarios neonatales o los folículos preantrales individuales con alimentación regular, y el paso final es fijar o congelar el tejido para su análisis histológico o molecular. En última instancia, el sistema de cultivo apoya el desarrollo de una manera altamente fisiológica y se puede utilizar para examinar la regulación del desarrollo de los folículos ováricos y para investigar las interacciones entre los folículos ováricos primordiales y en crecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que los folículos ováricos intactos se apoyan a través del desarrollo de los folículos, manteniendo su estructura tridimensional sin necesidad de matrices de soporte.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología ovárica, y también para ayudar a investigar los efectos de compuestos tóxicos como la quimioterapia, los medicamentos en el ovario y, por lo tanto, la fertilidad femenina. Primero tuvimos la idea de cocultivar diferentes edades y, por lo tanto, etapas de los folículos ováricos cuando discutimos cómo investigar los efectos del crecimiento de los folículos en el grupo de folículos primordiales en reposo. Demostrando la técnica junto con Steph Morgan y Lisa Campbell estarán Vivian Allison, una técnica del laboratorio y Allison Murray, quien fue científica postdoctoral en el laboratorio durante muchos años. Ambos ayudaron a desarrollar aspectos clave de la técnica para extraer las pipetas para este protocolo.

Caliente y doble las pipetas de vidrio sobre una llama y haga un corte limpio con un cortador de vidrio. A continuación, esterilizar el vidrio curvo a 160 grados centígrados durante unos 45 minutos. Se necesita práctica para obtener la curva correcta en la pipeta para su técnica.

Corte siempre la pipeta con un cortador de vidrio para que no quede vidrio irregular. También debe asegurarse de tener el extremo con el diámetro adecuado para su tejido Construido para esterilizar el medio de disección hecho de medio lebowitz L 15 con BSA a través de un filtro de 0,2 micras. Se trata de 25 milímetros de diámetro construidos para esterilizar el cultivo de ovario neonatal.

El medio pasa por otro de 0,2 micras filtra solo 25 milímetros de diámetro y lo recoge en un tubo estéril. A continuación, añada un mililitro del medio neonatal a cada pocillo de un 24. Cubra y transfiera una membrana a la superficie del medio en cada pocillo.

El medio de cultivo de folículos también se esteriliza por filtro como el medio de cultivo de ovarios. Luego, el aceite de silicona también debe esterilizarse con filtro. A continuación, repare placas de cultivo de 96 pocillos con 30 gotas de microlitros del medio folicular a lo largo de la fila superior.

Cubra cuidadosamente estos pozos con 70 microlitros de aceite de silicona. Alternativamente, el cocultivo de folículos y folículos requiere 100 microlitros de medio con una capa de 100 microlitros de aceite de silicona. A continuación, prepare placas de cocultivo de ovario folicular con un mililitro de medio por pocillo y una membrana po nuclear esterilizada por UV muy cuidadosamente colocada.

Comience transfiriendo un mililitro de medio de disección a cada placa de embrión de vidrio estéril. Después de colorear a los cachorros de cero a cinco días de edad posnatal, agarre la piel que cubre la pared abdominal con pinzas finas e inci la piel y la pared del cuerpo. Abra esta incisión grande que deja al descubierto el abdomen.

La vejiga suele estar congestionada en esta etapa y se puede perforar para facilitar la disección. Con unas pinzas de relojero, aparta las tripas. Luego, a ambos lados, siga los cuernos uterinos desde la vejiga hasta el riñón.

El ovario es una estructura en forma de nube ubicada justo debajo del riñón en la parte superior del útero. Agarre el ovario suavemente y con unas tijeras. Córtalo para liberarlo del útero.

Después de diseccionar ambos ovarios, transfiéralos a platos llenos de disección tibia. Medio. Use un microscopio de disección con una platina calentada a 37 grados centígrados para diseccionar los ovarios con agujas de insulina. Recorte el saco basal y cualquier exceso de material, incluida la trompa de Falopio, hasta que solo quede el ovario.

A continuación, transfiera cada ovario al pocillo de una placa preparada con una pipeta curva. Coloque un ovario en cada cultivo de membrana, el tejido cambia la mitad del medio cada dos días durante un máximo de seis días, al cambiar el medio, coloque la punta de la pipeta en el borde del pocillo de medio para evitar alterar la membrana. Después del cultivo, los ovarios pueden almacenarse congelados o fijados o en histología o inmunoquímica.

Después de recolectar los ovarios de ratones mayores en un plato de medio de disección tibio, retire el basa ovárico. Use agujas de insulina para recortar el saco basal y cualquier exceso de material, incluida la trompa de Falopio, hasta que solo quede el ovario. A continuación, corte los ovarios por la mitad con las agujas y transfiera con cuidado cada mitad a un cristal de reloj individual que contenga un mililitro de medio de disección.

Cubra los vidrios del reloj con una corredera de vidrio y guárdelos en el horno hasta por una hora lo antes posible. Trabajando bajo un microscopio con una etapa calentada en una campana de flujo de lámina, diseccione los ovarios en pedazos grandes usando agujas de insulina para identificar los folículos preantales tardíos. Los folículos preantales contienen dos o tres capas de células de granulosis y tienen un diámetro de alrededor de 180 a 200 micrómetros.

Diseccione cualquiera de estos usando una aguja en línea y una aguja de acupuntura asegurada por un soporte de aguja, evite dañar la lámina basal, pero asegúrese de eliminar el estroma S circundante. Esto requiere práctica. El folículo necesita algo de tejido fecal, pero no demasiado.

Además, si el proceso de disección es demasiado brusco, el folículo se daña y se rompe o muere. Durante el cultivo, el usuario preparó perpe para transferir cuidadosamente los folículos a un nuevo vidrio de reloj lleno de medio. Mantenga los folículos en la sección de calibre delgado del perpete utilizando un ocular calibrado ajustado a un microscopio de disección.

Mide los folículos. Si están a menos de 10 micrómetros de un diámetro de 190 micrómetros. Pueden usarse para el cultivo, desechar los otros folículos de los folículos seleccionados.

Elija solo los más saludables para el cultivo. Deben ser translúcidas, sin áreas reticas más oscuras, tener una lámina basal intacta y algo de tejido tecal adherido. Un buen rendimiento es de 10 a 15 folículos por ovario.

Ahora, usando un perpe curvo preparado, transfiera estos folículos a la placa de cultivo de 96 pocillos preparada. Coloque un folículo en cada pocillo debajo de la capa de aceite y cultive. Los folículos están hasta seis días todos los días.

Prepare una nueva fila con medios. Una hora o más tarde, transfiera los folículos a la siguiente fila de medios frescos y equilibrados o cultivos de folículos de folículos cocultivados de dos folículos uno al lado del otro en uno. Bueno, en lugar de transferencias, use una punta de gel fina para cambiar la mitad del medio cada dos días.

En el caso del ovario folicular, los cocultivos transfieren un folículo a un ovario neonatal colocado en una membrana en una placa de cultivo, colocan cuidadosamente el folículo al lado de un polo del ovario neonatal para que luego puedan entrar en contacto entre sí. Mantenga este cultivo durante un máximo de cinco días. Reemplazar 500 microlitros del medio cada dos días.

Los folículos preantales a menudo quedan encapsulados por los ovarios neonatales. Durante este cultivo, los ovarios neonatales del recién nacido se cultivaron durante seis días y se expusieron a tóxicos reproductivos. En el segundo día de cultivo, los tejidos se procesaron para determinar el número y la salud de las diferentes etapas de los folículos.

Uno de los tóxicos investigados fue el cisplatino. El otro tóxico investigado fue la doxorrubicina. Un experimento diferente investigó el efecto de la hormona estimulante del folículo gonadotropina y la hormona luteinizante en el crecimiento de folículos individuales.

Pero este análisis del tamaño de los folículos se midió periódicamente para mapear su crecimiento. Se investigó el cocultivo de folículos folículos utilizando un folículo que expresa GFP y un folículo de tipo salvaje, los procesos se extienden de uno a otro. El procesamiento inmunohistoquímico de este cocultivo reveló que los procesos de GFP se encontraban dentro de los tipos silvestres.

La capa tecal, los ovarios neonatales de tipo salvaje también se cocultivaron con el folículo que expresa GFP. En este escenario, los procesos de GFP migraron a través del intersticio ovárico. El cultivo de ovario neonatal es un método bastante sencillo, pero espere pasar algún tiempo dominando la técnica de disección de folículos preantrales intactos e intactos.

Esto es esencial para su correcto desarrollo. Tras el cultivo del folículo, los ovocitos pueden ser fecundados mediante fecundación in vitro, tras lo cual los embriones pueden ser transferidos a hembras pseudo preñadas y obtener crías vivas.