La medición de las larvas La actividad en el Drosophila Monitor de Actividad

Este informe describe un método para medir la actividad de las larvas de Drosophila utilizando el Monitor de Actividad de Drosophila TriKinetics. El dispositivo emplea rayos infrarrojos para detectar los movimientos de hasta 16 animales individuales. Los datos se pueden analizar para representar los parámetros de movimiento, incluidas las tasas y las posiciones de los animales dentro de las cámaras de ensayo.

El objetivo general de este procedimiento es analizar la actividad larvaria sin el uso de un complicado software de análisis de video. Esto se logra transfiriendo primero las larvas seleccionadas a un filtro de malla para limpiar los desechos. A continuación, las larvas individuales se transfieren a tubos de ensayo donde se aseguran mediante tapones de barrena, que se insertan en un monitor de actividad de Drosophila o en un dispositivo de presa.

Después de tres a cinco minutos de aclimatación, se toman registros del sistema DAM para su análisis. En última instancia, los movimientos larvales medidos de la madre se pueden utilizar para analizar diferentes parámetros de actividad para un genotipo determinado. Una ventaja que tiene esta técnica sobre los métodos existentes es que es automatizada y objetiva.

Si bien es lo suficientemente simple para las mediciones de actividad de rutina, muchos laboratorios ya cuentan con el equipo necesario que se puede adaptar fácilmente para su uso en larvas. El demostrador del procedimiento estará a cargo de Aiden McFarlin, un estudiante de pregrado de mi laboratorio. Este protocolo utiliza un dispositivo de monitoreo de actividad de drosophila multihaz M five o un dique.

Para montar la presa. En primer lugar, conecte el monitor a la unidad de interfaz de la fuente de alimentación o a la PSIU mediante el cable telefónico CAB six. A continuación, conecte la PSIU a una toma de corriente.

Una luz verde indicará una conexión adecuada. En tercer lugar, conecte la PSIU a través de un cable USB a una computadora para el registro de datos. Ahora instale y abra el programa del sistema DAM MB one V six X en la computadora.

Cuando se abre el software, comienza automáticamente a registrar datos en el control del software. Para el dique, establezca el intervalo de grabación deseado. Elija preferencias y luego haga clic encima o debajo de la opción de intervalo de lectura para seleccionar diferentes períodos de tiempo en los que se almacenarán los datos.

Hay una variedad de otros parámetros que se pueden establecer en preferencias y en tipo de datos de salida. Cada parámetro proporciona un análisis único de la actividad larvaria dentro del tubo. Se sugiere seleccionar todos los parámetros antes de la recopilación de datos.

Si no está seguro de qué parámetro desea medir para este ensayo, prepare un vial con larvas de forrajeo para cada genotipo que se pretende analizar. Utilice un entorno estándar y alimento para moscas para preparar los tubos de ensayo. Vierta una solución de barrena al 4% a una profundidad de 1,5 centímetros en una placa de Petri.

Esto se convierte en el material del tapón para el tubo de ensayo, demasiado denso para ser excavado en él. A continuación, asegúrese de que los tubos estén limpios y sin obstrucciones lavándolos con agua caliente. A continuación, calienta una botella exprimible con 100 mililitros de agua en el microondas durante 10 a 15 segundos o hasta que aparezca la condensación.

A continuación, invierta el frasco y exprima suavemente el aire caliente y húmedo en el tubo de ensayo. Cuando aparece una fina capa de condensación en la pared del tubo, está suficientemente húmedo. A continuación, retire el disco de gel del plato y colóquelo sobre una superficie de malla, a la que no se adhiera firmemente.

Para recolectar las larvas, prepare un filtro de malla estirando una malla de nailon de grado de serigrafía sobre un embudo. Asegure la malla en el cuello del embudo con una banda elástica y coloque el embudo en un vaso de precipitados. Ahora saque una espátula llena de alimento que contenga larvas de forrajeo de la botella de cultivo y transfiéralas al filtro de malla.

Lave la comida de las larvas a temperatura ambiente, agua del grifo, las larvas individuales se pueden recoger de la malla con un pincel. Transfiera las larvas aproximadamente 1.5 pulgadas a un tubo de ensayo húmedo. Luego selle el tubo taponándolo con una barrena.

Esto se hace presionando un extremo del tubo en el gel dos veces y el otro extremo. Una vez que la presión obligue a uno de los dos tapones a salir en el extremo opuesto, a medida que se cargan los tubos, colóquelos en la presa. A continuación, ajuste la posición de cada tubo para que el animal no pueda moverse más allá del alcance de los sensores.

A continuación, fije los tubos al dispositivo con un anillo de masilla. Registre la actividad de LARVAS en una incubadora de 20 grados centígrados para evitar lecturas inexactas que puedan ocurrir debido a sombras, luces fluorescentes o variaciones de temperatura en el laboratorio. En la incubadora.

Utilice iluminación LED no fluorescente durante la grabación. Antes de recolectar datos, deje que las larvas se aclimaten durante cinco minutos. Puede ser útil realizar una prueba sin animales para asegurarse de que las condiciones de luz no activen los sensores DAM.

Después de cinco minutos, inicie el software DAM preconfigurado para iniciar la grabación. El ensayo puede durar 30 minutos sin condensación ni alimentos adicionales. Es esencial que antes de registrar se haya seleccionado el parámetro de actividad destinado al análisis en las preferencias.

Si no se selecciona, esta actividad no estará disponible para el análisis post hoc. Una vez completado el tiempo de grabación deseado, cierre el software DAM, los datos se guardan automáticamente en la carpeta de datos del sistema DAM. Transfiera el archivo de datos a una carpeta separada para que pueda procesarse más tarde.

Los tubos de ensayo se pueden limpiar con agua hirviendo para su reutilización. Para procesar los datos sin procesar en un formato comprensible, abra la aplicación de escaneo de archivos DAM y elija. Seleccione la carpeta de datos de entrada, luego elija la carpeta de datos y el archivo deseado y seleccione la opción de escaneo.

Por último, seleccione la longitud del contenedor para el período de lectura deseado. Esto organiza los datos sin procesar en parámetros establecidos por el operador. Ahora seleccione el tipo de datos de salida para analizar la configuración de movimiento deseada.

Si la longitud del contenedor es mayor que el intervalo de lectura del sistema seleccionado, vaya al menú de lecturas adicionales y seleccione la opción dos sumas en contenedores. A continuación, guarde el archivo con un nombre adecuado en la misma carpeta a la que se transfirieron los datos sin procesar. Usando un programa de hoja de cálculo estándar, abra el archivo guardado.

Dependiendo del tipo de datos analizado, la hoja de cálculo debe leerse de manera diferente. Por lo general, para medir movimientos o conteos, el período de tiempo del estudio se registrará numéricamente, mientras que cada tubo de lectura individual recibirá una letra designada. Normalmente, las columnas K a Z representan las ranuras de los tubos de ensayo y las filas representan los puntos de datos recopilados.

Si, por ejemplo, se recogieron movimientos durante 20 minutos, en un minuto, los intervalos promediaron las 20 filas para calcular un número medio de movimientos por minuto y otras mediciones. Se realizó un estudio de respuesta a la temperatura de las larvas de tercer estadio de la cepa W 1 1 1 8 utilizando el dispositivo de monitoreo para detectar diferencias en la locomoción de las larvas. A siete temperaturas diferentes, cada larva se analizó durante 20 minutos.

Claramente, las larvas se volvieron significativamente más activas a medida que el ambiente se calentaba. A modo de comparación, se probó un mutante hipoactivo de la cepa W 1 1 18 llamado inactivo. El análisis indicó que las larvas inactivas eran significativamente menos móviles que un control para probar los límites de detección del ensayo.

Se realizó una comparación de larvas en diferentes estadios, mientras que las larvas en estadio eran mucho más pequeñas que las terceras en las larvas estrella. La actividad de la primera y la segunda en las larvas estrella fue detectable y medible al observar los cambios en la actividad con el tiempo en el dispositivo. Se encontró que la actividad de la tercera en las larvas estrella en cada minuto del ensayo de 20 minutos se mantuvo relativamente constante.

Una vez dominado, este protocolo proporciona un método preciso, simple y rentable para evaluar los parámetros básicos de la actividad larvaria en una variedad de condiciones experimentales.