Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

Aquí, presentamos un protocolo para cultivar arcos faríngeos para estudiar la biología de las células progenitoras del corazón y los músculos y su microambiente.

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el mantenimiento, la migración y el destino de los progenitores cardíacos y musculares en el mesodermo faríngeo. Esto se logra diseccionando primero los arcos faríngeos de un embrión de ratón recién cosechado. A continuación, los arcos se colocan en una película de medios para facilitar su fijación.

Las células dentro o que migran desde el explan faríngeo se monitorean diariamente. En última instancia, el trazado del linaje de fluorescencia basado en Cree se puede utilizar para rastrear la migración, la diferenciación y la renovación de los progenitores cardíacos y musculares dentro de los arcos faríngeos. La principal ventaja de esta técnica es que es el único sistema ex vivo para estudiar in vitro una población renovada de progenitores cardíacos o musculares y su microambiente.

La demostración de este método es fundamental, ya que los arcos parentales en los embriones de ratón de 9,5 días de edad tienen solo de dos a 300 micrómetros de tamaño, lo que los hace muy difíciles de identificar y diseccionar sin visualización previa. Antes de iniciar el procedimiento. Coda 12, placa de pocillos con PBS suplementado con 10% de FBS.

Después de una hora, reemplace la solución de recubrimiento con 200 microlitros de medio libre de suero por pocillo. Girando la placa para asegurarse de que una película de medio cubra toda la superficie de los fondos de los pozos. A continuación, rocíe y limpie el vientre de una rata embarazada sacrificada con etanol al 70%.

Luego, con herramientas estériles, haga una incisión de 0,5 centímetros en la región naval. Agarre la piel por encima y por debajo de la incisión y tire suavemente en direcciones opuestas. Luego, haga una incisión en forma de V en la membrana desde el ombligo hasta los ovarios a cada lado del abdomen para revelar el útero.

Pellizque el oviducto que conecta el útero con el ovario con fórceps y el oviducto del lado del ovario con unas tijeras para liberar el útero del ovario. Tirando suavemente del útero hacia arriba por el uct. Cortar el útero para liberarlo de la región de la vejiga.

A continuación, tire del útero más hacia arriba por el UCT y corte el UCT por el otro lado, liberando el útero de la cavidad abdominal. Transfiera el útero a un tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de PBS frío y estéril con calcio y magnesio. Agitar suavemente el tubo durante 10 segundos para lavar la sangre.

Luego, use fórceps para transferir el útero a un plato de 10 mililitros y agregue cinco mililitros de PBS frío al tejido. A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, utilice dos pares de pinzas para abrir suavemente el útero y diseccionar los sacos amnióticos que contienen los embriones de uno en uno. Luego, para cada embrión a su vez, pellizque y retire suavemente el saco amniótico con un par de pinzas y use el otro par para cortar y liberar el saco del embrión.

Coloque el embrión de lado y use fórceps para cortar el primer y segundo arco posteriormente al corazón entre el arco y la bolsa faríngea. Después de voltear el embrión y cortar el arco del otro lado se acaba de demostrar. Cortar el tracto de salida cardíaco que conecta los arcos con el embrión y extraerlos.

Pellizque y suelte cada uno de los dos arcos faríngeos del tracto de salida cardíaco restante y los cuatro endodermos intestinales. A su vez, luego transfiera los tejidos al centro de los pocillos individuales de la placa de 12 pocillos recubierta teniendo cuidado de que los arcos no estén cubiertos por el medio. Para facilitar la fijación, incubar los arcos en condiciones de cultivo celular.

Después de dos horas, agregue 200 microlitros de 37 grados centígrados, medio libre de suero por los lados de los pocillos, teniendo cuidado de que los arcos permanezcan adheridos e incuben los tejidos durante la noche. Al día siguiente se confirmó visualmente que los arcos todavía están unidos. Luego agregue suavemente 200 microlitros más de medio libre de suero de 37 grados Celsius a los pocillos.

Si los tejidos se desprenden y comienzan a flotar, retire suavemente el medio con una pipeta sin quitar los arcos hasta que solo quede una película de medio. A continuación, utilice la punta de la pipeta para mover los arcos de nuevo al centro del pocillo y volver a incubar los tejidos. Cada dos días, reemplace cualquier medio evaporado con 100 a 200 microlitros de medio fresco durante el desarrollo.

Los progenitores del músculo facial y del corazón se pueden rastrear a medida que proliferan y migran desde el primer y segundo arco faríngeo para convertirse en la musculatura de la cabeza y el corazón, respectivamente. El cultivo de los arcos faríngeos ofrece una forma única de estudiar el desarrollo cardíaco y muscular en detalle ex vivo. Utilizando el sistema de bloqueo CRE, la progenie del mesodermo del ratón puede ser rastreada por reporteros fluorescentes sobre la expresión de Cree dentro de las 24 a 48 horas de cultivo ex vivo a las 36 a 72 horas.

La formación de cardiomiocitos puede confirmarse visualmente mediante la contracción espontánea de grupos de células migratorias dentro del segundo arco, así como mediante el análisis de marcadores específicos de cardiomiocitos. Después de tres a siete días de cultivo, el miotubo y la formación de músculos faciales se pueden visualizar como células alargadas y espontáneas dentro del primer arco, y mediante el análisis de marcadores musculares específicos después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de las células madre del corazón y los músculos monitorearan y estudiaran directamente los progenitores en expansión y sus nichos in vitro.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar arcos forales desde embriones de ratón en desarrollo hasta culturales in vitro, lo que permite el estudio del desarrollo progenerativo del corazón y los músculos, ex vivo.