Name: En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende a modelar el microambiente neural canceroso in vitro utilizando ganglios de raíz dorsal y células tumorales. Esta técnica permite estudiar interacciones neuronales y desarrollar terapias dirigidas contra la invasión neural.

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Se agradece a Edith Suss-Toby su ayuda en la microscopía de lapso de tiempo y el análisis de imágenes. Se agradece a Nofar Rada por el trabajo artístico.

De cuatro a seis semanas de edad C57BL / CJ ratones (Harlan, Jerusalén, Israel) se utilizaron en el experimento de acuerdo con la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care especificaciones. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión y el Departamento de Agricultura regulaciones. 1. La recolección de la Médula Espinal <ol><li> La eutanasia del ratón usando una cámara de CO 2. Evitar dislocación cervical, ya que podría causar daños a las raíces ganglionares debido a fuerzas de cizallamiento. De aquí en adelante, realizar todos los pasos en condiciones estériles. </li><li> Remojar los animales abajo con etanol al 70%. Este paso es importante para la esterilización y para prevenir el pelo de arrastre a través de los órganos internos. </li><li> Deje el ratón para secar a partir de etanol. Evitar cualquier contacto de etanol con los órganos internos debido a la neurotoxicidad. </li><li> Después de secar el ratón, la posición que el uso de clavos en posición prona(boca abajo). Coloque los pernos en cada extremidad posterior y la extremidad anterior. </li><li> El uso de pinzas, hacer una incisión de línea media que se extiende desde el cuello craneocaudal posterior a la columna vertebral lumbar. A continuación, levante colgajos dérmicos bilateralmente con unas pinzas y exponer el tejido subcutáneo. </li><li> Se palpa el cráneo del ratón hasta llegar a la unión craneocervical. Con unas tijeras perpendiculares al animal, cortar a través de los músculos cervicales y la columna vertebral en la unión craneocervical (el 7º vértebra cervical), el uso de fórceps pesados. Diseccionar la columna vertebral caudal e Impuestos Especiales de la columna vertebral con unas pinzas pesados ​​hasta alcanzar el nivel lumbar (posterior nivel de las extremidades). </li><li> Realizar una transección caudal completa a nivel de la columna lumbar (la 5ª vértebra lumbar) con unas pinzas pesadas. </li><li> Mover el ratón sobre (boca arriba). No hay necesidad de cubrir la incisión desde el DRG se extrae de los niveles vertebrales inferiores y no el cuello uterino. </li><li> Cortar hacia abajo en la línea media del cuello para el abdomen, retraer elpiel lateralmente y luego se corta para abrir el peritoneo. </li><li> Retire los órganos internos dentro del peritoneo (hígado, bazo, páncreas, estómago, intestino) y en bloque. A continuación, retire los órganos retroperitoneales (es decir, los riñones y el páncreas). Craneal, abrir la pared torácica. </li><li> El uso de pinzas y una cuchilla quirúrgica, corte de las costillas, dejando 5 mm de costillas bilateralmente lejos de la columna vertebral. En este punto, la columna vertebral está separado del resto del cuerpo. </li><li> Lavar la columna vertebral de la sangre con (4 ° C) fresco salina tamponada con fosfato fría (PBS) dos veces. </li></ol> 2. Aislamiento de la raíz dorsal ganglios (DRG) <ol><li> Utilice un estereomicroscopio con un aumento de 4X. </li><li> Coloque la columna vertebral en una plataforma no absorbente no adherente (Telfa / nylon). Coloque la cara columna hacia arriba en la misma orientación cráneo-caudal. </li><li> Retire cualquier músculos espinales y tejido conectivo. Utilice las costillas como un punto de referencia para los nervios, ya quesalir de la columna vertebral. Costillas también protegen los nervios de los instrumentos quirúrgicos. El DRG se encuentran en la torácica, lumbar, cervical y los sitios de las vértebras. </li><li> A continuación, utilizando las tijeras cortan el cuerpo vertebral en la línea media y exponen a la médula espinal y las raíces DRG por la retracción lateral suave del cuerpo vertebral. </li><li> En el espacio intercostal, siga el nervio periférico medial a lo largo del lateral de la costilla a la DRG. </li><li> Identificar los GRD. Parece que la yema de &#39;huevo frito&#39; tumbado sobre el nervio. </li><li> Cortar el distal del nervio intercostal a la DRG dejando 2-3 mm de nervio distal a los ganglios, para ser utilizado para la retracción. Esta &quot;cola&quot; se eliminará después de la cosecha. </li><li> Agarre el nervio uso de fórceps. Pellizcar el cuerpo DRG sí causará daño celular neuronal y debe ser evitado. </li><li> El enfoque de la DRG proximal a lo largo de su apego a la médula espinal, a través de su anterior y raíces posteriores. </li><li> Aplicar la retracción suave para la DRG tirando de la EFrentes nervio (muñón nervio intercostal) lateralmente, y se corta la parte anterior y posterior raíces cerca de la DRG. </li><li> Mantenga el DRG en una placa de 35 mm de Petri llena de fresco, hielo DMEM frío suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, aminoácidos no esenciales al 1%, y 1% de piruvato de sodio. </li></ol> 3. Implantación en la placa de Petri <ol><li> Realice los siguientes pasos en el hielo utilizando puntas de pipeta pre-enfriado para evitar la solidificación del ECM. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico con una ampliación 2-4X, colocar una placa de Petri de vidrio inferior 35 mm en una cuadrícula de papel. IMPORTANTE: El trabajo sobre hielo con el fin de mantener el ECM en estado líquido. Crear un punto de diámetro de 1 mm (aproximadamente 20 l) de crecimiento factor de ECM-agotado en el centro de la rejilla. </li><li> Bajo visualización directa, coloque el DRG en el centro de la mancha ECM cerca de la parte inferior del plato. NOTA: Las células cancerosas se utilizan en este protocolo son murinos células del cáncer pancreático (KPC) established a partir de muestras tumorales recién aisladas de ratones KPC como se describe en otro lugar 19. </li><li> células de cáncer de cosecha 40.000 a partir de cultivos confluentes, se lavan una vez con PBS, y volver a suspender en 40 l ECM en hielo. </li><li> Bajo visualización directa de la rejilla utilizando un microscopio estereoscópico micras medida 500 en cada dirección desde el DRG. En este punto sembrar lentamente 10.000 células / l 10 ECM. Utilice una punta de preenfriado 2-10 l para inyectar las células cercanas al fondo del plato, evitando su propagación en la matriz o desprendimiento de la matriz. (Figura 1). </li><li> Deja el plato dentro de una campana de flujo laminar durante 10-15 minutos para solidificar. Evitar el secado de ECM. </li><li> Añadir lentamente DMEM, preparado como se ha mencionado previamente, contra la pared lateral de la placa. Añadir suficiente medio para cubrir la ECM (alrededor de 2 ml). </li><li> Poner el plato de nuevo a la incubadora a 37 ° C. </li><li> Sustituir el medio con medio fresco al día siguiente. </li><li> Reemplazar el medio cada 2 días. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Adquisición de Datos, por lapsos de tiempo videomicroscopia <ol><li> En el día 7 después de la implantación, tomar el plato para microscopía lapso de tiempo. Tenga en cuenta que ciertas células pueden requerir la adquisición antes debido a una migración más rápida. </li><li> Durante la formación de imágenes en vivo, poner la caja en un entorno cerrado a una temperatura media de 37 ± 0,1 ° C y 5% de CO2. </li><li> Registrar las células mediante el uso de una carga acoplada cámara del dispositivo colocado en el microscopio. </li><li> Tomar imágenes digitalizadas cada 10 minutos durante un máximo de 72 horas para seguir la locomoción celular de tres a seis células diferentes. </li><li> Reemplazar medio después de 24 horas. </li><li> Realizar la adquisición de datos y análisis sencilla utilizando el software microscopio. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Para aplicaciones más avanzadas (es decir, el seguimiento de celda en 2D o 3D) utilizar un software especializado (como Imaris 4D). Nota: Este software determina las coordenadas xy de una célula acualquier momento dado, junto con la distancia desde el origen, y la velocidad de movimiento. </li><li> Calcula la velocidad media mediante la medición de la distancia de desplazamiento entre las posiciones posteriores en intervalos de 10 min. Calcular el índice de migración de Forward (FMI) que es la distancia de la parte frontal de la célula de neuritas y describe el movimiento unidireccional de las células hacia el DRG. </li></ol>

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<li>Weizman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+mediate+gemcitabine+resistance+of+pancreatic+adenocarcinoma+by+upregulating+cytidinedeaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase.</a> Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).</li>
</ol>

Esta investigación fue apoyada por el premio al desarrollo de la carrera de investigación Barbara S. Goodman del ICRF (2011-601-BGPC) y una subvención de la Fundación Binacional de Ciencias de Estados Unidos e Israel. No se deben hacer otras divulgaciones financieras de los autores.

En este artículo se presenta un modelo in vitro que recapitula el microambiente canceroso en el nicho de los nervios, el modelo DRG. El vídeo muestra todos los pasos a partir de reconocer puntos de referencia anatómicos tales como el DRG en el ratón, su extracción y, finalmente, su cultivo en ECM. También se presenta Co-cultivo de la DRG junto con células cancerosas. No existen otros modelos para la investigación invasión perineural in vitro descritos en la literatura que hacen de este modelo esencial ...

Los tumores sólidos difunden en tres formas principales: la invasión directa, diseminación linfática, y la propagación hematógena. Sin embargo, hay un cuarto medio de propagación del cáncer que con frecuencia se tiene en cuenta, la difusión a lo largo de los nervios. Invasión neural cancerosas (CNI) es una ruta bien conocida de la propagación del cáncer, especialmente en los cánceres de cabeza y cuello, próstata 1 2, 3 y el páncreas. 4-8 CNI se produce en más de 80% de individuos con adenocarcinoma de páncreas, lo que lleva a un tumor retroperitoneal propagarse a través de los nervios ganglio celiaca. Estas células cancerosas neurotrópico tienen una capacidad única para migrar unidireccionalmente a lo largo de los nervios hacia el sistema nervioso central (SNC). 9 Este hallazgo sugiere que el microambiente perineural puede ser explotado por las células cancerosas, proporcionando factores que apoyan el crecimiento maligno. Uno de los pocos modelos in vitro para la investigación CNI es el ganglio de la raíz dorsal (DRG) / modelo de célula de cáncer. este model se utiliza con frecuencia para estudiar la interacción paracrina entre las células del estroma y el cáncer neural. 10-18 En este líneas celulares de cáncer humano modelo, el ratón o se cultivan en matriz extracelular (ECM) adyacente a preparaciones de DRG cultivadas recién disociados. Este artículo de vídeo muestra la aplicación de vitro CNI en en el adenocarcinoma ductal pancreático.

<table><tbody><tr><td>Equipment:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de operación</td><td>Leica</td><td>M205</td><td></td></tr><tr><td>Time Lapse System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gripps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z309036</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placas de Petri, fondo</td><td>de vidrio de groot</td><td>60-627860</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; </td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiales:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold PBS</td><td>Industrias biológicas</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Industrias biológicas</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Renio</td><td>10108165</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Industrias biológicas</td><td>01-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Industrias biológicas</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Industrias biológicas</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel con factor de crecimiento</td><td>agotado Trevigen</td><td>3433-005-01</td><td></td></tr></tbody></table>

en vitro modelado de canceroso neural invasion: modelo del ganglio de la raíz dorsal

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Una forma en que los tumores sólidos se diseminan es a través de la invasión neuronal. Esta ruta es bien conocida en los cánceres de cabeza y cuello, próstata y páncreas. Estas células cancerosas neurotrópicas tienen una capacidad única para migrar unidireccionalmente a lo largo de los nervios hacia el sistema nervioso central (SNC). El modelo de ganglios de raíz dorsal (DRG)/células cancerosas es un modelo in vitro tridimensional (3D) que se utiliza con frecuencia para estudiar la interacción entre el estroma neural y las células cancerosas. En este modelo, las líneas celulares de cáncer de ratón o humano se cultivan en ECM adyacentes a preparaciones de DRG cultivado recién disociado. En este artículo se demuestra el protocolo de aislamiento de DRG en ratones y su implantación en placas de Petri para su cocultivo con células de cáncer de páncreas. Cinco días después de la implantación, las células cancerosas entraron en contacto con las neuritas DRG. Más tarde, estas células formaron cabezas de puente para facilitar una migración neurotrópica polarizada más extensa de las células cancerosas.

<html> Utilizando imágenes de microscopía de vídeo, el DRG se puede ver brotar neuritas 5-7 días después de la implantación, mientras que las células de cáncer de migración lejos de sus colonias hacia el DRG. Por el 7º día después de la implantación, las células cancerosas entran en contacto con las neuritas (Figura 2). El índice de migración hacia delante de las células de cáncer pancreático utiliza...

Este artículo de video muestra el uso del modelo de ganglios de la raíz dorsal (DRG)/células cancerosas en el adenocarcinoma ductal pancreático.

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

El objetivo general de este modelo es recrear el microambiente neural canceroso. Esto permite la exploración de las interacciones entre células cancerosas y neuronas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microambiente tumoral, como la interacción entre células tumorales y neuronas, y la influencia mutua entre cada uno de estos componentes.La principal ventaja de esta técnica es que es confiable, fácil de realizar y aborda tanto los factores celulares como cerebrales en el nicho neural. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo terapéutico y la diana farmacológica de factores clave en los procesos de remodelación neural e invasión durante la progresión del cáncer. Tras sacrificar al animal en una cámara de CO2, empape el pelaje con etanol al 70% y deje que se seque.Coloque al ratón en posición prona y realice una incisión media que se extienda craneocaudalmente desde la nuca hasta la columna lumbar. A continuación, utilice pinzas para levantar bilateralmente los colgajos dérmicos y exponer el tejido subcutáneo. Palpe el cráneo del ratón hasta identificar la unión cráneo-cervical.Use tijeras colocadas en ángulo perpendicular al

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, describimos el método para co-cultivar ganglios de la raíz dorsal y células cancerosas en la membrana corioalantoidea de pollo o CAM para estudiar la invasión perineural.

Membrana corioalantoidea de pollo o modelo tumoral CAM: un método in ovo para simular la invasión perineural de células tumorales

En este video, demostramos el procedimiento para desarrollar un modelo de invasión de células de cáncer perineural in vitro mediante el cultivo conjunto de células de cáncer neurotrópico y ganglios de raíz dorsal de ratón. El modelo se puede utilizar para realizar ensayos de cáncer, produciendo resultados rápidos y reproducibles.

Establecimiento de un modelo de cocultivo tridimensional de ganglios de raíz dorsal murina y células cancerosas: un modelo in vitro para estudiar la invasión de células cancerosas perineurales

En este video, demostramos un método in vitro para el co-cultivo de DRG y células cancerosas para estudiar el neurotropismo y la invasión neuronal.

Modelado de la invasión neuronal cancerosa in vitro: un método para el cocultivo de ganglios de la raíz dorsal y células cancerosas

En este video, desarrollamos un modelo de ratón in vivo para la invasión perineural mediante la inyección de células de cáncer de páncreas en el nervio ciático. Este modelo ayuda a cuantificar el alcance de la invasión y a estudiar las interacciones entre las células cancerosas y los nervios.

Modelo de invasión perineural murina: generación de un modelo in vivo para simular la invasión perineural en el nervio ciático de ratón

Este video muestra un método para desarrollar ganglios de raíz dorsal o cultivo de explantes DRG y modelos celulares disociados de DRG utilizando tejidos DRG aislados de ratón. Estos modelos ayudan a estudiar diversos mecanismos con las interacciones neuron-gliales en un entorno controlado.

Generación de explante de ganglios de raíz dorsal y cultivo celular disociado

La invasión perineural (PNI) es una característica común del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), que confiere tasas de supervivencia más bajas. Sus mecanismos son poco conocidos. Utilizando neuritas generadas a partir de ganglios de la raíz dorsal murina confinados a una matriz semisólida, se pueden investigar las vías involucradas en el PNI de las líneas celulares HNSCC.

Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

Describimos un modelo murino en vivo de invasión perineural por células de cáncer pancreático syngeneic de inyección en el nervio ciático. El modelo permite la cuantificación del grado de invasión del nervio y apoya la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la invasión perineural.

Un modelo de nervio ciático murinos In Vivo de invasión Perineural

La invasión perineuronal es un fenotipo agresivo para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello y otros tumores. El modelo de membrana corioalantoica de polluelos se ha utilizado para estudiar angiogénesis, invasión de cáncer, y metástasis. Aquí demostramos cómo este modelo se puede utilizar para evaluar la invasión perineural in vivo.

El modelo Chick Chorioalantoic Membrane In Vivo para evaluar la invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello

Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).

Cosecha, incrustación y cultivo de ganglios de la raíz dorsal en dispositivos multicompartimentales para estudiar las características neuronales periféricas

Este protocolo describe los métodos para establecer cultivos de montaje completo y disociados de ganglios de raíz dorsal de ratón (DRG) y su uso para evaluar las interacciones tumor-nervio.

Establecimiento de modelos in vitro del cultivo de ganglios de la raíz dorsal: enfoques complementarios para investigar la diafonía entre el cáncer y los nervios

Aprende a modelar el microambiente neural canceroso in vitro utilizando ganglios de raíz dorsal y células tumorales. Esta técnica permite estudiar interacciones neuronales y desarrollar terapias dirigidas contra la invasión neural.

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

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