Name: Exacta y fenol ADN Determinación del sexo libre del día 30 de los embriones de porcinos por PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a determinar el sexo de embriones porcinos de día 30 mediante PCR sin fenol, usando ADN libre de tóxicos y cebadores específicos. Este método seguro y económico facilita la investigación en fisiología reproductiva.

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Los autores desean agradecer la colaboración y las contribuciones financieras de la siguiente agencia de financiación de la investigación: Alberta ganado y la carne Agencia Ltd, CRC carne de cerdo, carne de cerdo Alberta, Hypor Hendrix Genetics Company y CRSNG CRSNG.

De acuerdo con el Consejo Canadiense para el manejo de estos animales y con la aprobación de la Política Animal de la Facultad y el Comité de Bienestar - Ganadería de la Universidad de Alberta, las cerdas gestantes fueron sacrificados por personal capacitado aproximadamente a día se recogieron 30 del embarazo y embriones. Utilice guantes de examen en todo momento durante los procedimientos. 1. Recogida y almacenamiento de la muestra <ol><li> La eutanasia cerda usando un perno cautivo seguido por desangramiento. Usar guantes para recoger los aparatos reproductores y embriones de cada cerda sacrificados. Nota: recogida rápida de muestras y embriones de transferencia a hielo seco o nitrógeno líquido se traducirá en los tejidos de mayor calidad para otros trabajos moleculares como los microarrays y qPCR. </li><li> Diseccionar el útero y separar con cuidado todos los embriones dentro de sus membranas placentarias extraembryonic de la pared uterina subyacente 21. Asegúrese de que no hay contaminación tejido materno. </li><li> Relongitud del cable y el peso de todos los embriones viables antes de la congelación. </li><li> Recoger cada embrión individual y de inmediato se envuelve en una hoja de aluminio a presión antes de la congelación con nitrógeno líquido. </li><li> La transferencia de los embriones congelados de nitrógeno líquido directamente en un congelador a -80ºC. </li></ol> 2. Los embriones de molienda <ol><li> Etiquetar todos los tubos de muestra (15 ml) con el ID de muestra necesaria para el número de muestras a analizar. </li><li> Llene el recipiente térmico con hielo seco a la mitad e insertar el tubo de muestras de pre-marcado en el hielo seco. </li><li> Use guantes de invierno con otro par de guantes de examen en la parte superior para la transferencia de los morteros y manos de pre-enfriado de -80 ° C congelador para secar el depósito de hielo. </li><li> Coloque el embrión congelado en el interior del mortero en el hielo seco. </li><li> Verter nitrógeno líquido adecuado para cubrir el embrión y se muele con la mano del mortero en un polvo fino. </li><li> Transferir el polvo embrión a un tubo de muestra pre-marcado con un microspatula (Figura 1) y colocar el tubo en un congelador a -80 °. </li><li> Use un mortero previamente enfriado limpia y mano de mortero para cada embrión y cambiar los guantes de examen después de moler cada embrión para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. </li></ol> 3. Preparación de ADN genómico utilizando Modificado de sodio Método Hidróxido <ol><li> Etiqueta de todos los tubos de microcentrífuga (1,5 ml) necesarios para el número de muestras a analizar. </li><li> La transferencia de los tubos de muestra que contienen polvo embrión a partir de la -80 ° C congelador a un recipiente con hielo seco antes de comenzar. </li><li> Pipetear 180 l de NaOH 50 mM (hidróxido de sodio) en cada tubo de microcentrífuga de pre-marcado. </li><li> Encienda una incubadora y de precalentamiento a 95 ° C. </li><li> Utilice un palillo de dientes para transferir la cantidad correcta de polvo de embriones (alrededor de 5 a 10 mg) (Figura 2) del tubo de muestra en un tubo de microcentrífuga de pre-marcado que contiene la solución de NaOH 50 mM. </li><li> tire up el mismo palillo de dientes lentamente para visualizar el lisado ADN como una pegajosa, pegajosa, sustancia blanca transparente similar (Figura 3). </li><li> La transferencia de los tubos de microcentrífuga con lisado de ADN a la incubadora pre-calentado a 95 ° C durante cinco minutos. transferir inmediatamente el tubo a una caja de espuma de poliestireno lleno de hielo. </li><li> Añadir 20 l de 1 M Tris-HCl directamente en el tubo de centrífuga y se mezcla golpeando suavemente el tubo. Use un papel de pH para asegurarse de que el pH es de aproximadamente 8,0 (Figura 4) antes de la centrifugación. Nota: Cuando se trata de un gran número de preparaciones de muestra, es aceptable para recoger al azar algunas muestras para comprobar el pH. </li><li> Centrifugar el tubo con el lisado de ADN en 2000 xg en una microcentrífuga durante dos minutos a temperatura ambiente para eliminar los residuos de tejido sin disolver. </li><li> Transferencia de 150 l del sobrenadante transparente de acabado en un nuevo tubo o placas de 96 pocillos. Nota: El lisado ADN claro está lista para usarse como una plantilla en PCreacción R y es estable a 4 ° C durante dos semanas, o puede ser mantenido a -20 ° C durante un año. </li></ol> Los cebadores de PCR 4. Diseño Sexo-específicas <ol><li> Obtener los números de acceso para la región determinante del sexo porcino Y (SRY) (NM_214452.3) y los genes y las proteínas ligadas al cromosoma X con dedos de zinc (ZFX) (XM_005673501.1) de la página web NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /. </li><li> Copiar y pegar estos números de acceso NCBI a una herramienta de diseño de la cartilla en línea. Nota: La mejor información cebadores incluyendo la longitud, Tm y GC%, así como el tamaño del producto de PCR (pb), se genera en la pantalla del ordenador (Figura 5). </li><li> Validar la especificidad de estos cebadores utilizando el programa explosiva de nucleótidos (Blastn) en contra de la actual base de datos genómica porcina 104 para asegurar que estas secuencias sólo se encuentran en X y el cromosoma Y de SRY y ZFX respectivamente (Figura 6). </li></ol> 5. Genomic DNA PCR directamente a partir de ADN lisados <ol><li> Utilizarsólo 1 l de lisado de ADN como una plantilla para una 15 l de reacción de PCR. Nota: Un método de cribado de alto rendimiento para placas de 96 pocillos PCR se puede realizar en forma similar utilizando una pipeta multicanal. </li><li> No la siguiente sólo para la primera PCR: preparar un tubo de PCR para el control negativo sin molde y dos tubos adicionales para controles positivos mediante la adición de 1 l (0,5 ng) de ADN genómico porcino sexo conocido obtenido comercialmente. Más tarde, incluir una muestra de la última análisis sexado éxito como un control positivo y para correr junto con la nueva reacción de PCR para la determinación del sexo. </li><li> Utilizar cualquier enzima de PCR Ready Mix HotStart y preparar una mezcla maestra mediante la adición de cebadores y agua libre de nucleasa en función del número total de las reacciones de PCR. Añadir 1 l de lisado de ADN en un tubo de PCR pre-existente con 14 l de la mezcla maestra de PCR. Añadir cebadores de tal manera que la concentración final de los cebadores a partir de dos genes específicos del sexo es de 0,3 M en total de 15 l PCR reaction. </li><li> Configurar el siguiente programa de PCR en un termociclador: 95 ° C durante 3 min, 35 ciclos cada uno con un paso 20 seg de fusión 98 ° C, seguido de una etapa de recocido 15 seg a 65 ° C, seguido de una etapa de elongación 15 sec a 72 ° C. En una etapa final, se incuban las reacciones durante 1 min a 72 ° C y continuar incubar a 4 ° C hasta la retirada del tubo de PCR para la verificación de la electroforesis en gel para determinar el sexo. Nota: Las condiciones de PCR y optimización están de acuerdo con el manual del kit de PCR se menciona en la Tabla de Materiales. </li><li> Añadir la cantidad apropiada de invernadero SYBR fluorescente mancha de gel de ADN no tóxico cuando se prepara un gel de agarosa TBE 2%. Nota: El bromuro de etidio puede ser sustituido por tinción fluorescente verde-si no está disponible. </li><li> Añadir 1,5 l de la colorante de carga (10x) en el tubo de PCR y mezclar bien pipeteando el tampón de reacción PCR de arriba a abajo. </li><li> Carga de 10 l de la muestra en el pocillo y rONU del gel de agarosa con valores de voltaje adecuados (aparato de gel pequeño a 100 V, el aparato de gel de 96 pocillos a 150 V hasta que la banda de tinte se ejecuta medio camino a través del gel). </li><li> Observar y ajustar las intensidades de las bandas con la configuración de la luz fluorescente usando un escáner láser y capturar una imagen del gel. Nota: imager gel común puede ser sustituido por el gel con bromuro de etidio. </li><li> Determinar el sexo de los embriones de cerdo mediante la identificación de los embriones con una banda como una hembra y dos bandas como un macho (Figura 7). </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La mayoría de los protocolos existentes en relación con la asignación del sexo porcina ADN embriones sólo son adecuados para la etapa temprana etapa de pre-implantación 15,16. Hemos desarrollado con éxito un protocolo adecuado para la selección de embriones porcinos durante el final de la gestación. Sobre la base de estudios con etapas similares de desarrollo de embriones a partir de estudios previos 6,18, el presente protocolo se considera que es más seguro y de bajo costo. <p class="jove_cont...

El cerdo doméstico se ha convertido en un tema de investigación fundamental en el desarrollo, la genética y la nutrición en ambos sectores humana y el ganado. El potencial de los cerdos como modelos para la investigación biomédica humana se puede atribuir a sus similitudes fisiológicas. En la ganadería, la manipulación de la proporción de sexos puede aumentar la eficacia de selección y mejoramiento genético programas 1. El sexado de embriones individuales es una herramienta fundamental utilizada en muchas investigaciones experimentales, incluyendo pero no limitado a genotipo, la epigenética y X inactivación del dimorfismo sexual durante el desarrollo embrionario temprano 2. Los estudios en ratones sugieren que la dieta materna y otros factores pueden dar lugar a un desequilibrio de género 3. En los cerdos, las causas de la proporción de sexos desequilibrio incluyen raza paterna 4, 5 capacidad uterina, y el estado metabólico de la cerda 6. Dado que las diferencias observadas en los embriones y camadas pueden ser influenciados por SExual dimorfismo, los investigadores deben ser conscientes de embrión de sexo y relaciones sexuales antes de sacar conclusiones con respecto a su investigación. El desarrollo de herramientas y protocolos eficaces para el sexado de embriones de cerdo en el día 30 del desarrollo será discutido aquí. Varios métodos de asignación del sexo se han desarrollado para los estudios genéticos en organismos modelo y el ganado. Sobre todo en la ganadería, la identificación de los embriones tempranos masculinos y femeninos es una práctica muy común para mejorar la selección genética para programas de mejoramiento. Los primeros embriones de cerdo en el cariotipo utilizando Giemsa 7 o la intensa fluorescencia 8,9 técnicas se han utilizado para la asignación del sexo. Sin embargo, estos métodos son mucho tiempo y no es adecuado para el cribado de un gran número de embriones con rapidez y precisión. El método de tipificación sexo más eficaz es la amplificación de ADN usando un calor de la polimerasa de ADN estable y un par de cebadores. sexado de ADN por el método de PCR es más específica, rápida y sensible, orequiriendo ólo una mínima cantidad de materiales celulares. La primera determinación del sexo del embrión basados ​​en la PCR se realizó en los seres humanos 10, y más tarde en los ratones 11, ganado, búfalos 12 13 y ovejas 14 embriones antes de la implantación. En el cerdo, se estableció el método de tipificación de ADN sexo más temprana para los embriones antes de la implantación a través de un único par de cebadores de ADN específico del cromosoma Y 15. Sin embargo, se seleccionaron los cebadores de PCR más comunes para la determinación del sexo del cromosoma Y del gen SRY específica macho 16 y la región discriminativo no sexual de un gen dedo de zinc ubicada en ambos X e Y cromosoma 17. Posteriormente, estos cebadores se han aplicado para determinar el sexo de los embriones del día 30 en este estudio con una mayor especificidad de los cebadores para detectar sólo el cromosoma X de un gen zinc-finger. El ADN genómico a partir de embriones antes de la implantación de la especie porcina se puede extraer mediante la exposición de un blastocisto intacta para amortiguar con proteinase K 16 o tomando una biopsia de unas pocas células de la escisión temprana individuo embriones de 15 años y utilizarlos para la PCR directa. Sin embargo, la liberación de ADN a partir de sangre porcina, cabello, tejidos o una gran conceptus en unos pocos centímetros de tamaño no se hace efectiva utilizando el método de la proteinasa K. Métodos de extracción de ADN para estos materiales se han establecido utilizando ya sea el tiempo que consumen los protocolos de fenol / cloroformo 6 o kits 18 basados ​​caro columna. Con el fin de evitar el uso de productos químicos potencialmente tóxicos, hay una tendencia a desarrollar métodos de extracción de ADN de bajo costo, fácil y sin fenol. Este tipo de protocolo para el aislamiento de ADN genómico PCR calidad de ratón 19 y de pez cebra 20 tejidos se ha establecido el uso de hidróxido de sodio caliente y Tris (HotSHOT). Este estudio proporciona un protocolo para la obtención de ADN con pares de cebadores dúplex modificados y rediseñados para HotSHOT sexo PCR escribiendo directamente a partir de lisados ​​de células de embriones porcinos día 30 conalta precisión.

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>otra polimerasa Taq de arranque en caliente se puede usar después de la optimización</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>El bromuro de etidio se puede sustituir por SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig ADN genómico femenino y masculino</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 & GP-160-M5</td> Se <td>pueden utilizar controles positivos de los tejidos del ADN sexual conocido.</td></tr><tr><td>Escáner láser Typhoon FLA 9500</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>se puede utilizar otro sistema de imagen</td></tr><tr><td>Guantes de examen de nitrilo blando gratuitos</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>cualquier otro guante de examen se puede utilizar</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, sólido&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Grado de Biología Molecular</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>resistente al calor</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>Uso como incubadora para 95 &#176; C, no es necesario usar el calentador</td></tr><tr><td>Palillo de dientes</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Se puede usar cualquier palillo de madera redondo -</td></tr><tr><td>madera de calidad Microcentrífuga 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>Este modelo fue descontinuado. Pero otro modelo más nuevo se puede usar</td></tr><tr><td>Microespátula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>esterilizado en autoclave antes de usar cada vez.</td></tr></tbody></table>

exacta y fenol adn determinación del sexo libre del día 30 de los embriones de porcinos por pcr

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

La investigación en la programación prenatal en el cerdo ha demostrado que el sexo del embrión o feto en desarrollo puede influir en el resultado del desarrollo. Por lo tanto, la capacidad de determinar el sexo de un embrión es necesario en muchos experimentos particularmente en relación con el desarrollo temprano. El presente protocolo demuestra una preparación barata, rápida y no tóxica de ADN genómico de cerdo para el uso con la PCR. Día 30 embriones deberán ser recogidos con humanidad de acuerdo con las directrices establecidas por la Política Institucional Animal y comités de bienestar para el presente protocolo. La preparación de todo el embrión para esta técnica de sexado basado en la PCR implica simplemente moliendo la de embriones congelados hasta un polvo fino usando un mortero previamente enfriado y mano de mortero. DNA PCR calidad se libera de una pequeña cantidad de polvo de embriones mediante la aplicación de una incubación caliente en un reactivo de lisis alcalina. A continuación, la solución de ADN se mezcla con tampón de neutralización y se utilizó directamente para PCR. Dos pares de cebadores se generan a DETECt sexo específico región determinante del cromosoma Y- (SRY) y la región ZFX del cromosoma X con alta precisión y especificidad. El mismo protocolo se puede aplicar a otros embriones alargados (Día 10 a Día 14) antes que el día 30. Además, este protocolo se puede llevar con placas de 96 brotado cuando detección de un gran número de embriones, por lo que es factible para la automatización y la alta la asignación del sexo rendimiento.

Un resultado representativo de la determinación del sexo de 345 DNA lisados ​​de cribado por PCR se muestra en la Figura 7 y se resume en la Tabla 1. Como puede verse en la figura 7, la temperatura de cebadores de recocido a 65 ° C es la condición óptima en este protocolo de PCR generando intensidad similar y tamaños de amplif...

Este protocolo describe un método preciso, económico, rápido y no tóxico para determinar el sexo del embrión porcino del día 30 utilizando el método de PCR después de moler un embrión hasta convertirlo en polvo sin extracción de cloroformo de fenol y purificación en columna de ADN.

Exacta y fenol ADN Determinación del sexo libre del día 30 de los embriones de porcinos por PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar con precisión el sexo de embriones de cerdo de 30 días, utilizando ADN libre de fenol obtenido de cada embrión y dos pares de cebadores específicos para el sexo en una reacción de PCR. Este método tiene el potencial de responder diversas preguntas relacionadas con la fisiología reproductiva en ganado, como el efecto de factores maternos en la proporción de sexos, incluyendo la capacidad uterina y el estado metabólico de la cerda, así como diversos factores paternos.La ventaja de esta técnica radica en que no utiliza productos químicos tóxicos como el fenol-cloroformo, ni columnas costosas durante la purificación del ADN. Así que comencemos. La demostración visual de este método es tan importante como la preparación del material.Los pasos son fáciles de aprender, pero es importante tener un cuidado especial en los detalles para evitar la contaminación cruzada de síntomas. Transfiera las muestras de embriones a un congelador de menos ochenta grados celsius, según indica el texto. Rotule los tubos de muestra con el ID de muestra necesario para el número de muestras que se analizarán.Utilice hielo seco para llenar hasta la mitad

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Este protocolo proporciona un conjunto práctico de los métodos, que permite extremadamente rápido, fácil, no invasivo, confiable y de bajo costo, la determinación del sexo molecular de las aves y su no invasivo, rápido, seguro y fácil de reconocer que marca poco después de la eclosión. Sólo se requiere un limitado manejo de los pollitos. Esta caja de herramientas práctica de métodos cumple en su totalidad con las RRR-directrices.

¿Quién es quién? Métodos no invasivos para Individualmente Sexuales y Mark altriciales Chicks

La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de transcripciones en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo proporciona un procedimiento técnico optimizado en una matriz bovina personalizada de dos colores utilizando embriones bovinos de día 7 para demostrar la viabilidad de usar una baja cantidad de ARN total.

Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para delfín espermatozoides recolección, criopreservación y rendimiento de fecundación in vitro heteróloga utilizando ovocitos bovinos.

Tonina Delfín (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolección, criopreservación y fecundación In Vitro heteróloga

Aquí, introducimos un método de secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) con las ventajas de un tiempo de respuesta corto, bajo costo y alto rendimiento.

Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Utilizando imprimaciones específicas de especies, cpsDNA fue cuantificado por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono.

Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante

El presente estudio reporta un protocolo para el tamizaje cromosómico de embriones humanos que utiliza medio de cultivo gastado, lo que evita la biopsia embrionaria y permite la identificación de ploidía cromosómica mediante NGS. El presente artículo presenta el procedimiento detallado, que incluye la preparación del medio de cultivo, la amplificación del genoma completo (WGA), la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) y el análisis de datos.

Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica

El desarrollo temprano depende de los productos heredados por la madre, y el papel de muchos de estos productos es actualmente desconocido. En este documento, describimos un protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenotipos de efecto materno en una sola generación.

Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Aprenda a determinar el sexo de embriones porcinos de día 30 mediante PCR sin fenol, usando ADN libre de tóxicos y cebadores específicos. Este método seguro y económico facilita la investigación en fisiología reproductiva.

Exacta y fenol ADN Determinación del sexo libre del día 30 de los embriones de porcinos por PCR

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