Exacta y fenol ADN Determinación del sexo libre del día 30 de los embriones de porcinos por PCR

El objetivo general de este procedimiento es identificar con precisión el sexo de los embriones de cerdo del día 30, utilizando ADN libre de fenol obtenido de cada embrión. Y dos pares de cebadores específicos para cada sexo para una reacción de PCR. Este método tiene el potencial de responder a varias preguntas relacionadas con la fisiología reproductiva en el ganado, como el efecto de los factores maternos en la proporción de sexos, incluida la capacidad uterina y el estado metabólico de la cerda, así como varios factores paternos.

La ventaja de esta técnica es que no hay productos químicos tóxicos como el fenol-cloroformo o columnas costosas durante la purificación del ADN. Entonces, pongamos el espectáculo en marcha. La demostración visual de este método es tan importante como la preparación de los síntomas.

Los pasos son fáciles de aprender, pero es importante tener especial cuidado en los detalles, para evitar la contaminación cruzada de los síntomas. Transfiera las muestras de embriones a un congelador de ochenta grados centígrados negativos, según el texto. Etiquete los tubos de muestra con el ID de muestra necesario para el número de muestras que se van a analizar.

Use hielo seco para llenar hasta la mitad un recipiente térmico e inserte un tubo de muestra pre-labrado en el hielo seco. Mientras usa guantes de invierno, con un par de guantes de examen encima, transfiera los morteros y majas preenfriados del congelador a ochenta grados centígrados negativos a un recipiente de hielo seco. A continuación, coloque un embrión congelado dentro del mortero sobre el hielo seco, luego, vierta nitrógeno líquido adecuado para cubrir el embrión.

Y use un mortero para molerlo hasta convertirlo en un polvo fino. Con una microespátula, transfiera el polvo del embrión a un tubo de muestra previamente diseñado y colóquelo en el congelador a ochenta grados negativos. Repita la molienda y congelación de cada embrión adicional, cambiando los guantes de examen entre muestras para evitar la contaminación cruzada.

Después de etiquetar todos los tubos microcentrifugados necesarios para el número de muestras a analizar, transfiera los tubos de muestra que contienen polvo de embriones del congelador de ochenta grados centígrados negativos a un recipiente con hielo seco. Pipetear 180 microlitros de hidróxido de sodio de 50 milimolares en cada tubo microcentrífugo pre-labrado. Precalienta una incubadora a noventa y cinco grados centígrados.

Con un palillo de dientes, transfiera aproximadamente de cinco a diez miligramos de polvo de embrión de un tubo de muestra a un tubo preetiquetado de hidróxido de sodio. Levante lentamente el palillo de la solución para visualizar el lisado de ADN como una sustancia blanca y pegajosa, similar a la transparencia. Transfiera las muestras con lisado de ADN a la incubadora de noventa y cinco grados centígrados durante cinco minutos, luego transfiera inmediatamente el tubo a un recipiente aislado lleno de hielo.

A continuación, agregue veinte microlitros de un tris-clorhidrato molar directamente en los tubos y golpee los tubos para mezclar suavemente. Con papel de pH, asegúrese de que el pH sea de aproximadamente 8,0. A continuación, centrifugar los tubos a dos mil g y temperatura ambiente durante dos minutos para eliminar los restos de tejido no disueltos.

Transfiera 150 microlitros del sobrenadante transparente superior a tubos nuevos. O bien, una placa de 96 pocillos. Y almacene a cuatro grados centígrados hasta por dos semanas.

O bien, veinte grados centígrados bajo cero durante un año. El éxito de este protocolo depende de lo específico que diseñe su cebador en los cromosomas X e Y. Entonces, ¿cómo te aseguras de que estén en los cromosomas X e Y?

El uso de NCBI Map Viewer es la mejor manera de mostrarlo. Para diseñar cebadores específicos para el sexo para la PCR, utilice el sitio web del NCBI para obtener los números de acceso para la región de determinación del sexo del signo de poro Y.Or SRY y la proteína de dedo de zinc ligada al X, o ZFX. Copie y pegue los números de accesión en una herramienta de diseño de cebadores en línea.

Utilice el blasto de nucleótidos o el blasto N para validar la especificidad de los cebadores con la base de datos genómica de signos de poro actual 104. Para entrar en las secuencias, solo se localizan en el cromosoma X e Y para SRY y ZFX, respectivamente. Para llevar a cabo la PCR con los lisados de ADN, utilice cualquier enzima de PCR de mezcla lista para el inicio en caliente y prepare una mezcla maestra añadiendo dos cebadores específicos para el sexo a una concentración final de 0,3 micromolares en una reacción de PCR de 15 microlitros.

Por primera vez, las reacciones preparan un tubo de PCR para el control negativo sin plantilla, y dos tubos adicionales para los controles positivos mediante la adición de un microlitro de ADN genómico de signo de poro sexual obtenido comercialmente. Para las siguientes rondas de PCR, incluya un microlitro de una muestra del último análisis de sexado exitoso como control positivo. Configure el siguiente programa de PCR en un termociclador y realice la PCR.

Para variar las muestras después de la PCR, prepare un gel de agarosa al 2% TBE con tinción de gel de ADN cibernético o bromuro de etidio. Agregue 1,5 microlitros de tinte de carga 10X a las muestras antes de cargarlas en el gel y correr. Observe y ajuste las intensidades de la banda bajo luz fluorescente y capture una imagen del gel.

Identificar embriones con una banda como hembra y dos bandas como machos. Aquí se muestra un resultado representativo para la determinación del sexo de 345 lisados de ADN examinados por PCR. La temperatura óptima de recocido del cebador de 65 grados centígrados es visiblemente más alta que la TM de los cebadores que se muestran aquí para generar una intensidad similar y tamaños de ampilcones previstos.

Aquí se presentan dos productos amplificados de SRY y ZFX. La muestra de lisado de embriones femeninos produce solo una sola banda de 506 pares basados en fragmentos de ADN del gen ZFX ubicados en el cromosoma X. Todos los embriones masculinos producen dos fragmentos de ADN con la misma intensidad de 400 pares de bases para SRY y 506 pares de bases para ZFX.

Como se muestra aquí, los lisados de ADN no mostraron ninguna inhibición de la reacción de PCR después de examinar 345 embriones. Solo tres individuos no fueron sexados y el porcentaje de embriones femeninos fue ligeramente superior al de los machos. Una vez que se domina esta técnica, desde la molienda hasta la realización de la PCR, se tarda aproximadamente una hora en procesar alrededor de diez embriones.

Al realizar esta técnica, es importante evitar la contaminación cruzada, especialmente cuando se transfiere polvo de embriones a las trompas. Siguiendo este procedimiento, podemos utilizar otros métodos como la metilación del ADN, los microarrays y la secuenciación para investigar los efectos genómicos y epigenéticos de la nutrición y las enfermedades infecciosas entre sexos. El desarrollo de esta técnica allanará el camino para que los investigadores en las áreas de fisiología reproductiva y ciencia animal realicen investigaciones relacionadas con el dimorfismo sexual en varias especies de ganado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar cebadores específicos para el sexo, abstraer el ADN de los embriones y realizar una reacción de PCR utilizando lisados de ADN. Recuerde que trabajar con hielo seco es bastante peligroso, así que tome las precauciones adecuadas: use guantes y gafas.