Un Modelo de Cultura de Rebanadas Organotípicas de Glioblastoma Humano para el Estudio de la Migración de las Células Tumorales y los Efectos Específicos para el Paciente de los Medicamentos Anti-Invasivos

Los modelos ex vivo actuales de glioblastoma (GBM) no están optimizados para el estudio fisiológicamente relevante de la invasión tumoral humana. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y mantenimiento de cultivos de corte organotípico de tejido humano GBM fresco. Se proporciona una descripción de microscopía de lapso de tiempo y técnicas de análisis de migración celular cuantitativa.

El objetivo general de este procedimiento es observar y analizar los comportamientos migratorios invasivos en células primarias de glioblastoma humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurooncología, como ¿cuáles son las propiedades fenotípicas y moleculares que subyacen a las diferencias específicas del paciente en la progresión de la enfermedad y las respuestas al tratamiento? La principal ventaja de esta técnica es que permite la manipulación directa de las células primarias preservando la arquitectura tisular in vivo y la heterogeneidad celular del glioblastoma.

Comience usando pinzas estériles para colocar insertos de cultivo de PTFE vacíos en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga un mililitro de medio de mantenimiento de cultivo en rodajas por pocillo. Cuando se hayan agregado todos los insertos, coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada con camisa de agua a 37 grados Celsius y 5% de CO2. A continuación, coloque los trozos de tejido tumoral en una placa de Petri que contenga un medio de procesamiento helado y use una pipeta para lavar suavemente el tejido tres veces con medio fresco para eliminar los glóbulos rojos adherentes.

Después del tercer lavado, use el bisturí para cortar los pedazos del tumor en tiras de aproximadamente tres por tres por 10 milímetros, eliminando cuidadosamente cualquier vaso adherido y evitando el tejido necrótico o cauterizado. Cuando se haya recortado todo el tejido, agregue de cinco a siete milímetros de agarosa líquida de 37 grados Celsius en un molde de plástico de dos centímetros cúbicos y enfríe la agarosa en un lecho de hielo durante un minuto. Coloque de dos a cuatro tiras de tejido en la agarosa con el eje largo orientado verticalmente, dejando los tejidos en hielo durante otros dos a cinco minutos después de su colocación.

Con la agarosa se ha solidificado, corta los lados del molde con un bisturí para retirar suavemente la agarosa del molde. Y use una gota generosa de pegamento de cianoacrilato para fijar el bloque de agarosa a una placa de muestra de vibratomo. Cuando el pegamento se haya endurecido, sumerja el bloque de agarosa en un medio de procesamiento helado y utilice una pipeta de plástico estéril recortada para burbujear una mezcla de 5 % de CO2 y 95 % de O2 en el medio dentro del depósito de vibratomo.

Ajuste el grosor de la rebanada del vibratomo a 300 a 350 micras y ajuste la velocidad de avance de la cuchilla y la amplitud de la cuchilla de acuerdo con la consistencia del tejido y las especificaciones del vibratome. Obtener el número adecuado de rodajas de acuerdo con el análisis experimental planificado, utilizando una microespátula de acero inoxidable para transferir las rodajas a una placa de Petri que contenga un medio de procesamiento helado a medida que se adquieren. Cuando se hayan adquirido todas las rebanadas, use la microespátula para transferir cada rebanada a un solo inserto de PTFE.

Después de una incubación de 12 a 24 horas, equilibre una nueva placa de seis pocillos que contenga medio de mantenimiento de cultivo en rodajas frescas en la incubadora de cultivo celular durante 15 minutos. A continuación, utilice pinzas estériles para sujetar cada inserto por el borde y transfiera los insertos a los pocillos individuales de la nueva placa de seis pocillos. Entre siete y 10 días de cultivo, agregue suavemente de cinco a 10 microlitros de retrovirus que expresa GFP gota a gota en la superficie de cada corte de tejido y devuelva la placa a la incubadora.

Cuando la señal sea evidente, equilibre un mililitro de medio de rodaja fresca en un plato con fondo de vidrio y use pinzas estériles para transferir los insertos al plato. Coloque la placa en una incubadora superior de etapa de microscopio sellada de 37 grados, 5% CO2 de un microscopio confocal. Utilice un objetivo aéreo de larga distancia de trabajo 10x junto con imágenes de uno o varios fotones para capturar imágenes tridimensionales con resolución temporal de la migración celular.

Visualice el corte con el microscopio, ubicando un campo adecuado con una densidad adecuada de células tumorales marcadas con fluorescencia entre el borde del corte y el centro del tejido. A continuación, en el modo de análisis multidimensional del software de imágenes, establezca el centro de la pila Z de modo que todas las posiciones que se van a visualizar contengan una señal celular fluorescente visible y establezca un tiempo adecuado para cada adquisición de la pila Z. Para empezar, abra un archivo Z-stack en ImageJ y seleccione Imagen, Pilas y Proyecto Z.

Seleccione el primer y el último fotograma de tiempo de la pila Z para el análisis y elija Intensidad máxima como tipo de proyección para generar una proyección de intensidad máxima o una representación MIP. Para generar MIP para cada punto de tiempo de la serie a la vez, marque la casilla Todos los períodos de tiempo. Cree un MIP a partir de cada conjunto de imágenes de pila Z capturadas en cada región de la que se ha creado una imagen.

Abra MTrackJ desde el menú Plugins y haga clic en el botón Agregar. Para identificar manualmente el centroide del cuerpo celular en la célula tumoral de interés, haga clic en el punto central visualmente aproximado de la célula. Demarque la ubicación del cuerpo de la célula en cada período de tiempo de la serie de imágenes para crear una pista única para cada celda, marcando secuencialmente las ubicaciones del cuerpo de la siguiente celda.

Una vez que se ha realizado el seguimiento de una población de células en una microrregión tumoral determinada, utilice la función de medición para exportar todas las coordenadas de seguimiento de células y guardar los archivos en formato xls para su posterior análisis. Por último, utilice las coordenadas registradas para cada punto a lo largo de la trayectoria de migración de una célula para realizar análisis cuantitativos de la invasión tumoral. Los cortes de glioblastoma organotípicos muestran una concordancia con el tejido tumoral original a lo largo del cultivo, incluido el mantenimiento de la necrosis pseudoempalizada y la microglía durante un máximo de 15 días.

En condiciones hipóxicas, los cortes montan una respuesta fisiológica rápida, induciendo la liberación de factor de crecimiento endotelial vascular en el medio, un proceso que ocurre abundantemente dentro del microambiente del glioblastoma in vivo. La medición cuantitativa de las células tumorales que expresan GFP permite calcular la velocidad de migración y la direccionalidad de las células de glioblastoma a través de las regiones tumorales de las muestras. El seguimiento de la migración de células tumorales móviles entremezcladas pero morfológicamente distintas en la microglía dentro de un cultivo de cortes revela patrones de movimientos específicos del tipo de célula.

La obtención de imágenes de las regiones de corte aproximadamente cada 10 minutos también proporciona una resolución temporal adecuada para registrar imágenes de lapso de tiempo de las células tumorales en proceso de división celular. Por ejemplo, aquí hay un par de células en división que fueron capturadas mientras hacían una pausa para la migración, completaron la mitosis y reiniciaron la migración en sus células hijas sin demora, todo dentro de un período de tiempo de tres horas. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 90 minutos si se realiza correctamente.