Name: Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprende a generar cultivos primarios de fibroblastos de oreja y cola de ratón. Este protocolo permite usar tejidos almacenados hasta 10 días a temperatura ambiente, facilitando estudios de biología celular y diferencias entre células sanas y cancerosas.

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Este trabajo fue apoyado por la beca HUJ-CREATE de la NRF - MECANISMOS CELULARES Y MOLECULARES DE LA INFLAMACIÓN.

Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en el cumplimiento de las directrices institucionales hasta la eutanasia (El Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) directrices de la Universidad Nacional de Singapur y el Comité Nacional Asesor para el Laboratorio de Investigación Animal (NACLAR) directrices). 1. Los ratones <ol><li> Ordene un ratón del fondo genético apropiado. Este protocolo se basa en el tejido derivado de un ratón C57BL / 6. </li></ol> 2. Preparación de medio completo <ol><li> Preparar medio completo mediante la adición de los siguientes componentes a Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: 10% de suero de ternera fetal (FCS), 50 mM 2-mercaptoetanol, 100 mM de asparagina, glutamina 2 mM, solución de penicilina-estreptomicina al 1%. </li></ol> 3. Preparación de soluciones de enzima <ol><li> Prepare la solución de colagenasa D en un tubo de fondo cónico de 15 ml. <ol><li> Pesar 10 mg de colagenasa D. Dissolve colagenasa D en 4 ml de medio completo. </li></ol></li><li> Prepare la solución de pronasa en un tubo de 1,7 ml de microcentrífuga. <ol><li> Pesar 10 mg de pronasa. </li><li> Añadir 5 l de tampón Tris 1 M (pH 8,0). Añadir 1 l de 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Rellene con 494 l de agua estéril. </li><li> Incubar la solución de pronasa a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de colagenasa D-pronasa Mix (≤2 colas) Nota: Realice los pasos siguientes en una campana de cultivo celular estéril. <ol><li> Añadir 250 l de solución de pronasa a 4 ml de solución de colagenasa D. </li><li> Pasar la colagenasa-D pronasa mezcla a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras en un tubo de fondo cónico de 15 ml estéril. </li></ol> 5. Extracción de fibroblastos de oreja y rabo tejidos <ol><li> La eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales apropiados.</li><li> Coloque autoclave instrumentos quirúrgicos (tijeras y pinzas) en la campana de cultivo celular. </li><li> Añadir 10 ml de medio completo en dos platos de 10 cm de cultivo de células cada uno. </li><li> Cortar las orejas (~ 1 cm de radio) y 5 cm de la cola (de la punta de la cola) de un ratón con tijeras y se incuba durante 5 min en etanol 40 ml 70% en un tubo de fondo cónico de 50 ml estéril. </li><li> Oídos Aire seco y cola colocándolos en una abierta 10 cm placa de cultivo celular en la campana durante 5 min. Una vez secas, oído transferencia y piezas de la cola a dos placas de cultivo etiquetados &quot;orejas&quot; y &quot;cola&quot; que contiene 10 ml de medio completo como se describe en el paso 5.3. </li><li> Quitar el pelo de las orejas y la cola con unas tijeras. </li><li> Cortar orejas y rabo en trozos más pequeños de 3 mm de tamaño con unas tijeras. </li><li> Transferir los tejidos cortados en 1,8 ml viales criotubo etiquetados &quot;orejas&quot; y &quot;cola&quot; y añadir la solución D-pronasa suficiente de colagenasa para el volumen para alcanzar la marca de 1,8 ml en el frasco. </li><li> Pata los viales criotubo horizontalmente en una coctelera y agitar las muestras a 200 rpm durante 90 minutos a 37 ° C. </li><li> Después de 90 minutos de incubación, retire los viales criotubo de la coctelera y colocar los viales en el capó. </li><li> Añadir 10 ml de medio completo en dos 10 cm placas de cultivo de células, etiquetados &quot;oídos&quot; y &quot;cola&quot; cada uno, y poner un filtro de 70 micras de células en cada plato. </li><li> Coloca los tejidos del oído y de la cola digeridos en el colador de 70 micras de células en los platos en consecuencia etiquetados preparados en el paso 5.11 y con fuerza moler los tejidos utilizando una jeringa de émbolo 10 ml durante&gt; 5 min. Agite el filtro de células de vez en cuando en el medio para lavar las células del filtro de células. </li><li> Pipetear la suspensión de células de cada plato en tubos de fondo dos 15 ml cónicos etiquetados &quot;orejas&quot; y &quot;cola&quot;. Lave el plato y el colador con otros 10 ml de medio completo y añadir el medio a los tubos de fondo cónico de 15 ml apropiadas. </li><li> Centrifugar la célulasuspensión durante 7 min a 580 xg y ~ 4 ° C utilizando una centrífuga refrigerada celular. </li><li> Aspirar el sobrenadante, añadir 10 ml de medio completo al sedimento celular en los 15 ml de tubo de fondo cónico y resuspender las células. </li><li> Repita el paso 5.14 y 5.15. </li></ol> 6. Cultivo de mezcla de células <ol><li> Eliminar el sobrenadante. Asegúrese de que el sedimento celular se mantiene inalterado. </li><li> Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio completo y añadir la mezcla correspondiente a dos placas de cultivo celular de 10 cm etiquetados &quot;orejas&quot; y &quot;cola&quot;. </li><li> Añadir 10 l solución de anfotericina B (solución madre: 250 mg / ml) a la cultura. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora. </li><li> En el tercer día, sustituir el medio con medio completo fresco que contiene 10 ml 10 l de anfotericina B para eliminar los residuos (Figuras 1 y 2). </li></ol> 7. Sub-cultivo de fibroblastos <ol><li> When cultivo alcanza alrededor de 70% de confluencia (día 3-4 de la cultura) se elimina el medio y se lavan las células con solución salina estéril fosfato 5 ml 1x tamponada (PBS). </li><li> Retirar PBS y añadir 2 ml de solución de tripsina-EDTA 1x estéril a las células. </li><li> Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Después de 5 minutos, toque suavemente la placa de cultivo y añadir 6 ml de medio completo a las células. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml de fondo cónico y girar el tubo durante 5 min a 450 xg y ~ 4 ° C utilizando una centrífuga refrigerada celular. </li><li> Eliminar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento de células en 5 ml de medio completo. </li><li> Semilla 2 x 10 5 células en una placa de 10 cm de cultivo celular y se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora durante 3-4 días antes de repetir los pasos 7.1 a 7.6. </li></ol> 8. Preparación de Orejas para Embarque Nota: Realice tque los pasos subsiguientes en una campana de cultivo celular estéril. <ol><li> La eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales apropiados. </li><li> Coloque las tijeras y fórceps autoclave a la campana de cultivo celular. </li><li> Añadir 50 ml de medio completo en un tubo de fondo cónico de 50 ml. </li><li> Cortar orejas (~ 1 cm de radio) de un ratón con tijeras. </li><li> La transferencia de los oídos en el tubo de fondo cónico de 50 ml (como se ha preparado en el paso 3) el uso de fórceps. </li><li> Sellar el tubo inferior 50 ml cónico con parafina antes de enviar a temperatura ambiente en una caja apropiada. </li></ol>

<ol><li>Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+generated+by+oncogenic+transformation+of+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells.</a> Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).</li>
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<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+pluripotent+stem+cells+from+NOD+mouse+tail-tip+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts.</a> Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses financieros.

Aquí le ofrecemos un procedimiento experimental simple, barato y rápido para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. La extracción debe resultar en fibroblastos en división adherentes y rápidamente dentro de 3 días post-aislamiento del tejido. Una limitación importante de células primarias es la senescencia, una detención del crecimiento permanente 15. Utilizando el protocolo, cultivos de fibroblastos se pueden pasaron durante 5 a 6 veces antes de fibroblastos sen...

Las células primarias se derivan de tejido y se cultivaron viven bajo condiciones in vitro. Se asume generalmente que las células primarias se asemejan más el estado fisiológico y el fondo genético del tejido del que se derivan de líneas celulares inmortalizadas o tumorales 1. Por esa razón, las células primarias representan un modelo útil para el estudio de cuestiones biológicas 2,3. Sin embargo, a diferencia de las líneas celulares establecidas que crecen indefinidamente, células primarias, finalmente, se someten a la senescencia en la cultura y necesitan ser restablecido con frecuencia. Células primarias comúnmente usados ​​incluyen fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, células T, células B, macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) y células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC). Los fibroblastos se utilizan a menudo como modelo de cultivo celular primario. Ofrecen ventajas clave sobre otras células primarias. Los cultivos celulares son fáciles de establecer, fácilmente mantenido y no requieren Purificación de las células antes de la cultura. Tienen rápida proliferación inicial y sin necesidad de protocolos de medio o de activación especializados. Los fibroblastos se pueden transfectar eficientemente usando biológicos, químicos, físicos y protocolos de 4,5. Hay una posibilidad de almacenar oídos por hasta 10 días a temperatura ambiente antes de establecer cultivos celulares. Cultivos de fibroblastos son propicias para la visualización de los procesos citoplásmicos y adecuado para la reprogramación en células madre pluripotentes inducidas (iPS) 6. Los fibroblastos son células importantes del tejido conectivo que secretan las proteínas de colágeno y matriz extracelular 7. Ellos proporcionan el marco estructural en muchos tejidos 8 y juegan un papel esencial en la curación de heridas y reparación de tejidos 9,10. A continuación, describimos una (&lt;4 h) Protocolo simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos de las orejas y la cola de los ratones 11. El protocolo requiere un mínimo de ratónexperiencia para la cosecha de los tejidos (en contraste con otros protocolos 12,13) ​​y se puede utilizar para establecer cultivos de oídos almacenados en un medio a temperatura ambiente durante hasta 10 días.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternera fetal</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>Absolute para análisis</td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088866001</td><td>De Clostridium histolyticum, liofilizado, no estéril</td></tr><tr><td>Pronase proteasa</td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>De Streptomyces griseus&nbsp; Tampón </td></tr><tr><td>Tris (pH 8)</td><td>1ª BASE</td><td>1415</td><td>Grado ultrapuro</td></tr><tr><td>0,5M EDTA (pH 8)</td><td>1ª BASE</td><td>BUF-1053</td><td>Grado biotecnológico</td></tr><tr><td>10X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>1ª BASE</td><td>BUF-2040-10X4L</td> Solución de <td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td> de grado ultrapuro 10X <td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0,5% tripsina, 0,2% EDTA, tripsina gamma irradiada por el proceso SER-TINA, sin rojo fenol, en solución salina</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &mu; g/ml en agua desionizada, estéril filtrada</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Pinza Aesculap Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; M filtro de jeringa</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M filtro de células</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Émbolo de jeringa</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>Tubo criovial</td><td>NUNC 368362</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 10 cm</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Placa tratada con cultivo celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de fondo cónico de 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>tubo de fondo cónico de 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>GFL</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubación</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td> Microscopio óptico Zeiss <td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culturas generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Las células primarias se derivan directamente de tejidos y se cree que son más representativa del estado fisiológico de las células in vivo que las líneas celulares establecidas. Sin embargo, cultivos de células primarias por lo general tienen una vida finita y deben ser restablecido con frecuencia. Los fibroblastos son una fuente fácilmente accesible de células primarias. En este caso, hablamos de un procedimiento experimental simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El protocolo puede ser utilizado para establecer cultivos de fibroblastos primarios de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días. Cuando el protocolo se sigue cuidadosamente, las contaminaciones son poco probable que ocurra a pesar de la utilización de tejido no estéril almacenada por un tiempo prolongado en algunos casos. Los fibroblastos proliferan rápidamente en la cultura y se puede ampliar a un número considerable antes de someterse a la senescencia replicativa.

Extracción de fibroblastos de resultados de tejidos en una cantidad significativa de restos de tejido (Figura 1). En contraste con restos de tejido, los fibroblastos se adhieren a las superficies de plástico de cultivo de tejido entre el día 1 y 3 de la cultura. El medio de cultivos de fibroblastos se puede cambiar de forma segura en el día 3 de la cultura, lo que debería reducir significativamente los niveles de residuos presentes en la cultura (Figura 2). Los fibroblastos muestran una...

Se describe un procedimiento experimental sencillo y rápido para la generación de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El procedimiento no requiere una formación especial de los animales y se puede utilizar para la generación de cultivos de fibroblastos de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días.

Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

El objetivo general de este protocolo es establecer cultivos primarios de fibroblastos a partir de las orejas y la cola de ratones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como la diferencia entre células sanas y cancerosas. La principal ventaja de este estudio es que podemos generar fibroblastos a partir de orejas que se almacenaron en medio a temperatura ambiente durante hasta 10 días antes del aislamiento celular.Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología del ratón, también puede aplicarse a otros organismos animales mamíferos como ratas y conejos. Antes de recolectar los tejidos, cargue placas de cultivo de 10 centímetros con 10 mililitros de medio completo. Luego, después de que el ratón haya sido sacrificado, proceda a recolectar las muestras de tejido utilizando instrumentos esterilizados.Recolecte tejidos de oreja con un radio de aproximadamente un centímetro y recolecte unos cinco centímetros de tejido de cola. Transfiera los tejidos a un tubo cónico cargado con 40 mililitros de etanol al 70%. Deje que se remojen durante cinco minutos y luego séquelos al aire durante cinco minutos en una placa de cul

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento y mantenimiento de cultivos primarios de fibroblastos de la piel y el tejido pulmonar de los roedores salvajes.

El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

La calidad de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) está dictada por la cepa derecha de ratón tal como CF-1. Pluripotencia-MEFs de apoyo y medios de comunicación condicionado (CM) obtenido a partir de éstas debe contener concentraciones óptimas de activina A, Gremlin y Tgfβ1 necesarios para la Activina / Nodal y las vías de FGF de manera cooperativa mantener la auto-renovación y pluripotencialidad.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Este video describe el método rápido para aislar y cultivar los melanocitos y fibroblastos simultáneamente de la piel de la cría de ratón postnatal. Estas células se pueden mantener y manipular in vitro para estudiar la biología de las células de la piel, la cicatrización de heridas y el melanoma.

Cultivo rápido de melanocitos y fibroblastos murinos primarios: aislamiento de melanocitos y fibroblastos de muestras de piel murina completa

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

Describimos aquí un protocolo para la generación de iCMs utilizando la entrega mediada por retrovirus de Gata4, Tbx5 y Mef2c en una construcción policistrónica. Este protocolo produce una población relativamente homogénea de células reprogramadas con mayor eficiencia y calidad, y es valioso para futuros estudios de reprogramación de iCM.

Mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo Polycistronic Expresando relación óptima de Gata4, MEF2C y Tbx5

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).

Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Este protocolo describe un método rápido para generar simultáneamente cultivos de melanocitos y fibroblastos a partir de la piel de ratones de 0-4 días de edad. Estos cultivos primarios pueden ser mantenidos y manipulados in vitro para estudiar una variedad de procesos fisiológicamente relevantes, incluyendo biología celular de la piel, pigmentación, cicatrización de heridas y melanoma.

Generación rápida de cultivos primarios de melanocitos muritonos y fibroblastos

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

Aquí se presenta un protocolo para generar tejidos conectivos diseñados para un cultivo paralelo de 48 tejidos en una placa de múltiples pocillos con polos dobles, adecuado para estudios mecanicistas, modelado de enfermedades y aplicaciones de detección. El protocolo es compatible con fibroblastos de diferentes órganos y especies y se ejemplifica aquí con fibroblastos cardíacos primarios humanos.

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Aprende a generar cultivos primarios de fibroblastos de oreja y cola de ratón. Este protocolo permite usar tejidos almacenados hasta 10 días a temperatura ambiente, facilitando estudios de biología celular y diferencias entre células sanas y cancerosas.

Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

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