Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

El objetivo general de este protocolo es establecer cultivos primarios de fibroblastos a partir de las orejas y la cola de ratones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como la diferencia entre células sanas y cancerosas. La principal ventaja de este estudio es que podemos generar fibroblastos a partir de mazorcas que se almacenaron en medio a temperatura ambiente hasta 10 días antes de aislar las células.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología de los ratones, también se puede aplicar a otros organismos animales mamíferos como ratas y conejos. Antes de recolectar los tejidos, cargue placas de cultivo de 10 centímetros con 10 mililitros de medio completo. Luego, después de que el ratón haya sido sacrificado, proceda con el uso de instrumentos esterilizados para recolectar las muestras de tejido.

Recoja los tejidos de las orejas con un radio de aproximadamente un centímetro y recoja unos cinco centímetros de tejido de la cola. Transfiera los tejidos a un tubo cónico cargado con 40 mililitros de etanol al 70%. Déjelos en remojo durante cinco minutos y luego séquelos al aire en un plato de cultivo abierto de 10 centímetros durante cinco minutos en una campana de cultivo.

Después de que los pañuelos se sequen, transfiéralos a la placa cargada con medios. Ahora, corta el cabello de todos los tejidos con unas tijeras y luego corta los pañuelos en trozos de menos de tres milímetros. Transfiera el tejido cortado en cubitos a viales de criotubo y luego llene los viales con la solución de colagenasa D pronasa, hasta la marca de 1,8 mililitros.

Ahora incubar los tejidos a 37 grados centígrados, agitando a 200 rpm durante 90 minutos. En el capó, cargue un plato con 10 mililitros de medio completo. Sobre el plato, coloque un colador de células de 70 micras y, después de la incubación, cargue la digestión del tejido en el colador.

Ahora, muele los pañuelos en el colador con un émbolo. Hazlo durante al menos cinco minutos. De vez en cuando, agite el colador en el medio para lavar las células disociadas.

Es importante que los tejidos digeridos de la oreja y la cola se muelan bien para eliminar un buen número de células. También asegúrese de agitar el filtro de células después de moler los pañuelos. Esto eliminará las células adicionales del colador.

A continuación, recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, enjuague el colador con 10 mililitros de medio y agregue la solución de enjuague a la colección. Ahora, lava las celdas.

En primer lugar, gire las celdas hacia abajo en una centrífuga refrigerada. En segundo lugar, retire el sobrenadante. Y en tercer lugar, suspender las células en 10 mililitros de medio completo.

Repita el lavado una vez más y termine el procedimiento con las células en medio completo, listas para el cultivo. Para cultivar las células, primero, transfiera las suspensiones celulares a placas de cultivo de 10 mililitros. Luego, agregue 10 microlitros de solución de anfotericina B a cada cultivo.

Ahora, incuba las células durante tres días. Al tercer día, reemplace el medio con medio completo fresco con anfletericina B. Poco después, los cultivos alcanzarán un 70% de confluencia. En este punto, retire el medio y enjuague el cultivo con cinco mililitros de 1X PBS.

Luego, reemplace el PBS con dos mililitros de solución de tripsina EDTA 1X e incube las células durante cinco minutos. Después de la breve incubación, golpee suavemente los platos y agregue seis mililitros de medio completo fresco a cada plato. Ahora, pipetea las células liberadas de la placa en dos tubos cónicos de 15 mililitros.

Luego, gire los tubos durante cinco minutos a 450 G en una centrífuga refrigerada. Vuelva a suspender los pellets en cinco mililitros de medio completo y mida la densidad celular de las suspensiones. Ahora, alimente las células en platos de 10 centímetros a 200.000 por plato.

Incubar estas células durante tres o cuatro días hasta que alcancen el 70% de confluencia, y luego repetir el proceso de recolección y resiembra de las células a una densidad específica. Se pueden cultivar de esta manera hasta por 25 días. Tres días después de la extracción de la célula, había residuos significativos en el cultivo antes de intercambiar el medio.

Los restos de celda se resaltan con flechas blancas. La barra de escala representa 100 micras. El nuevo medio redujo significativamente los residuos de la célula.

Los cultivos de tres días de antigüedad producidos a partir de tejido que se había almacenado a temperatura ambiente durante 10 días demostraron que los fibroblastos son bastante resistentes. A partir de dichos tejidos, se logró una confluencia de fibroblastos del 70 al 80% después de cinco a seis días. Las células fueron marcadas con un marcador de fibroblastos, la vimentina, que se ve en rojo.

Se utilizó DAPI para etiquetar los núcleos, que se ve en azul. La barra de escala es de 10 micras. La tinción uniforme sugiere que el cultivo de fibroblastos es puro.

El protocolo descrito obtenía este resultado de forma rutinaria. Después de ver este video, debería haber entendido este final de cómo establecer cultivos primarios de fibroblastos de manera rápida y confiable. Al intentar este procedimiento, se debe prestar especial atención durante la extracción de fibroblastos de los tejidos, ya que una molienda insuficiente del tejido dará como resultado un menor número de células.