Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

El objetivo general de este procedimiento es aislar células endoteliales hemogénicas primarias de tejidos embrionarios murinos mediante la clasificación de células activadas por florescencia. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento fiable y específico de células endoteliales hemogénicas viables a partir de tejidos hematopoyéticos embrionarios. Estas células se pueden utilizar para su posterior análisis y cultivo.

Las células endoteliales hemogénicas, así como las células madre hematopoyéticas y progenitoras que se pueden aislar con este método, se utilizarán para ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación de su desarrollo y función. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades para identificar la población lateral de células que incluye las células endoteliales hemogénicas y las células madre y progenitoras hematopoyéticas. Los procedimientos de disección y escaneo de tejido embrionario serán demostrados por Kat Marcelo, una ex estudiante graduada de mi laboratorio.

Así como Emily Grits, actual becaria de investigación clínica. Y Jen Fang, actual postdoctoral. Comience limpiando todas las superficies de trabajo con etanol al 70% y colocando una almohadilla absorbente debajo de la superficie de la mesa de laboratorio.

A continuación, coloque un tallo eutanasiático en decúbito supino en la almohadilla inferior y rocíe generosamente la parte inferior del abdomen con etanol al 70%. Haga una incisión horizontal larga perpendicular a la línea media de la pared abdominal inferior. Seguido de dos incisiones horizontales adicionales de una pulgada que se extienden hacia arriba y hacia abajo desde el punto medio de la incisión horizontal.

A continuación, diseccionar la pared abdominal para exponer completamente los cuernos uterinos derecho e izquierdo que contienen los múltiples embriones en gestación. Con fórceps, agarre uno de los dos cuernos uterinos y use tijeras y fórceps para separar el útero del miometrio circundante. Y transfiera ambos cuernos a una placa estéril de cultivo de tejidos de poliestireno de 60 milímetros sobre hielo.

Coloque la placa debajo de un microscopio de disección con luz estándar y use las pinzas para separar cada unidad de placenta fetal. Para cada unidad, diseccione la capa muscular de cada saco uterino, revelando el saco gestacional subyacente y la decidua. Para aislar el saco vitelino, retira suavemente la mayor cantidad posible del saco del embrión encerrado.

Extraer el resto del tejido del saco yugo del embrión propiamente dicho en el origen embrionario de los vasos vitelinos, según sea necesario. Para aislar la aorta-gónada-mesonefrós o AGM, se secciona el embrión por debajo del corazón y las extremidades anteriores y se descarta la región del tórax y la cabeza. A continuación, secciona el embrión justo debajo de las extremidades traseras, y retira y desecha el tejido de la cola.

A continuación, retire las extremidades traseras y el exceso de tejido ventral de la sección restante que contiene AGM. A medida que se cosecha cada saco vitelino o AGM, agrupe los tejidos embrionarios en HPSS+ en tubos de 1,5 mililitros sobre hielo. Para generar una suspensión de una sola célula, centrifugar el tejido embrionario y volver a suspender el pellet de tejido en un mililitro de colagenasa tipo dos diluido en HPSS + Incubar el tubo durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Mezclando por inversión cada cinco minutos. Al final de la incubación, pase la muestra 10 veces a través de una pipeta P1000 para disociar suavemente y mecánicamente el tejido. A continuación, vuelva a girar la muestra, volviendo a suspender el pellet en un mililitro de HPSS helado + Ahora filtre la muestra a través de un colador de células de 70 micras y cuente las células.

Después del recuento, recoja las células nuevamente por centrifugación. Y vuelva a suspender el pellet a 37 grados centígrados DMN + a una concentración de una vez 10 a la sexta celdas por mililitro. Para etiquetar las celdas para la clasificación de fac, alícuota al menos 100 microlitros de celdas en tubos de 1,5 mililitros y agregue verapamilo diluido en etanol al 95% solo al tubo de control de hoechst más verapamilo a una concentración final de 50 micromolares.

Coloque todos los tubos a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, añada hoechst a los tubos de control hoechst only y hoechst plus verapamilo solamente, y el tubo de muestra hasta una concentración final de cinco microgramos por mililitro y vuelva a colocar los tubos a 37 grados centígrados durante una hora protegidos de la luz, mezclando suavemente los tubos por inversión cada 15 minutos. Al final de la incubación, centrifugar todas las muestras y diluir los gránulos a una concentración de una vez 10 a la quinta celda por mililitro en HPSS frío + Ahora agregue anticuerpos conjugados con fluorescencia a los tubos de control de solo anticuerpos apropiados, y al tubo de muestra a una concentración final de dos microgramos por mililitro para una incubación de 30 minutos en hielo protegido de la luz.

Al final de la incubación, centrifugar las muestras y volver a suspender los gránulos en 500 microlitros de HPSS helado. Cuele las muestras a través de las tapas de filtro de malla de los tubos de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros y coloque los tubos sobre hielo protegidos de la luz. A continuación, analice inmediatamente las células mediante citometría de flujo.

Siguiendo la discriminación estándar de celdas vivas y dobletes por dispersión hacia adelante y hacia los lados, los eventos de población lateral se visualizan en el gráfico lineal de puntos rojos de Hoechst frente a azules de Hoechst como un hombro desplazado a la izquierda desde eventos de población no laterales. Esta población lateral se reduce significativamente con el tratamiento con verapamilo. Las células de población no lateral se identifican como el grupo denso de células adyacentes a la población lateral.

La fracción de células de población no lateral contiene células endoteliales no hemogénicas que se distinguen además como eventos CD31 + CD45. Para identificar las células madre y progenitoras hematopoyéticas y las células endoteliales hemogénicas, se extraen puertas hijas de la fracción de población lateral que revela las células CD45+ y CD45. Las células endoteliales hemogénicas se identifican posteriormente a partir de células CD45 en un gráfico diferencial de cKit frente a Flk1 hijo como eventos dobles positivos.

Las células madre y progenitoras hematopoyéticas se identifican a partir de la fracción CD45+ en un gráfico hijo separado como células Flk1-cKit+. Siguiendo este procedimiento, se pueden configurar cultivos basados en metilcelulosa para proporcionar una evaluación funcional de la capacidad hematopoyética de las células aisladas o las células se pueden procesar inmediatamente para análisis de expresión génica y proteica. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas cuatro o cinco horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras protegidas de la luz y sobre hielo, a menos que se indique lo contrario para maximizar la viabilidad de la célula. Esta técnica ha permitido a los investigadores en el campo de la Biología Hemovascular explorar la especificación hemogénica de las células endoteliales y su producción de células madre y progenitoras hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células endoteliales hemogénicas de tejidos embrionarios murinos mediante citometría de flujo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.