Síntesis de Proteínas bioconjugados vía Química cisteína-maleimida

El objetivo general de sintetizar bioconjugados de proteínas a través de la química de cisteína-maleimida es garantizar la especificidad en el sitio de modificación de la proteína. Lo que a su vez afecta a la actividad del bioconjugado resultante, por ejemplo, los conjugados anticuerpo-fármaco. Si te interesa la estructura o función de las proteínas e investigas en nanomedicina, microscopía fluorescente o química de sistemas, esta técnica te ayudará a responder tus preguntas.

La principal ventaja de esta técnica es que es muy específica y de alto rendimiento en más condiciones. Para comenzar este procedimiento, disuelva 12 miligramos de citocromo C liofilizado en seis mililitros de tampón de fosfato de 20 milimolares. Pipetear 16 microlitros de solución DTT molar recién preparada en la solución proteica para reducir el citocromo C. Después de mezclar la solución, fíltrela a través de un filtro de jeringa de PBDF de baja unión a proteínas de 0,22 micras antes de inyectar en cualquier medio cromotográfico.

A continuación, purifique la solución bruta reducida de citocromo C mediante cromatografía líquida de proteínas rápida o FPLC. Después de equilibrar una columna extraña catiónica fuerte, cargue un mililitro de la solución en el circuito de inyección del instrumento. A continuación, comience un método de gradiente de 328 para cloruro de sodio de 450 milimolares, en cinco volúmenes de columna.

Supervise los canales de 280 y 410 nanómetros del detector de visualización UV y recoja los picos más grandes. Ahora aumente la concentración de sal a un molar para dos volúmenes de columna para saquear el citocromo C ISO2. Después de que se haya lavado la columna, vuelva a equilibrar con dos volúmenes de columna de tampón de fosfato de 20 milimolares antes de inyectar la siguiente alícuota cruda. En este punto, disuelva 0,9 miligramos del complejo de maleimida de rutenio apropiado en 600 microlitros de acetonitrilo.

Prepare una solución de TCEP de 10 milimolares disolviendo 2,87 miligramos de TCEP en un mililitro de agua ultrapura. Mezcle 11,4 mililitros de agua ultrapura, tres mililitros de una solución madre de fosfato y EDTA de 100 milimolares en un tubo de plástico de 50 mililitros. A continuación, añada 0,15 micromoles de citocromo C purificado a la solución de fosfato-EDTA.

Agregue 7,5 microlitros de la solución madre de TCEP a la solución de proteínas. Y dejar remover durante cinco minutos para reducir cualquier proteína que pueda haberse dimerizado debido a la oxidación de la cisteína. A continuación, añada 600 microlitros de la solución compleja de maleimida de rutenio a la solución de citocromo C tamponada reducida y deje la mezcla de reacción agitando en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas.

El orden de adición es de suma importancia. Es fundamental agregar primero la proteína, luego el agente reductor y al último la maliemida. Al día siguiente, concentre la mezcla de reacción por centrifugación utilizando un filtro de centrifugación de corte de peso molecular de 3,5 kilodalton.

Repita la centrifugación dos o tres veces con tampón de fosfato fresco de 20 milimolares hasta que el filtrado esté claro. Para la purificación a base de níquel, lave un mililitro de columna de cromotografía de afinidad metálica movilizada con tres mililitros de agua ultrapura, tres mililitros de solución de acetato de níquel de 100 milimolares y seis mililitros de agua ultrapura. Después de esto, conecte la columna cargada de níquel al FPLC entre el bucle de inyección y el detector de visualización UV.

A continuación, equilibre la columna con tres volúmenes de columna de fosfato de 20 milimolares y tampón de cloruro de sodio de 0,5 molares utilizando un caudal de 0,5 mililitros por minuto. Después de filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras, cargue 100 microlitros de la mezcla de reacción cruda en el circuito de inyección del instrumento. Lave la columna con tres volúmenes de columna de tampón para eluir el citocromo C sin reaccionar. A continuación, eluya el bioconjugado del citocromo C utilizando un gradiente de imidazol de cero a 125 milimolares en tres volúmenes de columna.

Una vez que el bioconjugado del citocromo C se haya eluido de la columna, lavar con tampón de imidazol de 250 milimolares durante cinco volúmenes de columna. A continuación, vuelva a equilibrar la columna con tampón de cloruro de sodio de 20 milimolares de fosfato 0,5 molar. A continuación, extraiga las fracciones bioconjugadas.

Y concentrado por centrifugación utilizando un filtro de espín de corte de peso molecular de 3,5 kilodalton. Después de la centrifugación, cargue el bioconjugado concentrado en casetes de diálisis cortados de 3,5 kilodalton de peso molecular y dialice con agua ultrapura durante la noche. Al día siguiente, determine la concentración de la solución bioconjugada concentrada pura mediante espectroscopia UV-Vis.

Utilizando el mismo valor de absorbtividad molar que el citocromo C ISO1 a 410 nanómetros. Almacene el bioconjugado restante en alícuotas de 25 microlitros a menos 20 grados centígrados. Para la electroforesis en gel, prepare 10 microlitros de cada muestra de proteína que se analizará diluyendo el bioconjugado con tampón de dodecil sulfato de litio premezclado hasta una concentración final de aproximadamente 20 microgramos por pocillo.

Luego caliente las muestras a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Después de dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, cárguelas con cuidado en un gel prefabricado de 12%bis tris, un milímetro y 10 pocillos utilizando puntas de pipeta largas para ayudar en la carga. Cargue un marcador de peso molecular de 10 proteínas previamente teñido en un pocillo central del gel para ayudar en el análisis.

Ahora haga funcionar el gel a 200 voltios durante 35 minutos. Una vez finalizada la ejecución, tiñe el gel con una solución azul comercial de Coomassie durante dos horas. Después de retirar la solución azul de Coomassie, lave el gel con agua ultrapura durante 48 horas.

Un aumento de masa en ausencia de proteína no reaccionada en el espectro de masa multi tof del bioconjugado del citocromo C demostró el éxito de la unión equivalente del complejo de maleimida de rutenio al citocromo C. Y la posterior purificación del bioconjugado. El rendimiento del bioconjugado del citocromo C es generalmente entre el 15 y el 27% y se puede calcular a partir del espectro UV-Vis. El bioconjugado consiste en una unión uno a uno de la maleimida a la proteína.

Lo cual se infiere comparando el espectro del bioconjugado con un espectro de adición predicho uno a uno de los materiales de partida. Además, la aparición de un nuevo pico en el cromatograma durante la purificación confirma la síntesis de una nueva especie. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en tres días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante tratar las soluciones de proteínas con cuidado y guantes para evitar la introducción de proteínas en las muestras. Este procedimiento se puede utilizar para la conjugación de otras maleimidas a proteínas que contienen cisteína. Para responder preguntas adicionales, como si la proteína de membrana está en una membrana protozoaria viva.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biomolecular comprendieran más sobre la función y la localización de las proteínas en restricciones basadas en viscales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la química de la maleimida de cisteína para etiquetar biomacromoléculas en altos rendimientos. No olvide que trabajar con productos químicos de investigación con propiedades desconocidas puede ser extremadamente peligroso.

Y que se deben tomar las precauciones adecuadas, como el EPP, al realizar este procedimiento.