Patch Clamp grabaciones en Intacto dorsal ganglios de la raíz de ratas adultas
September 29th, 2016
Este manuscrito describe cómo preparar ganglios de raíz dorsal intactos para grabaciones de pinza de parche. Esta preparación mantiene el microambiente para las neuronas y las células gliales satélite, evitando así los cambios fenotípicos y funcionales observados con las neuronas DRG disociadas.
El objetivo general de este experimento es introducir métodos para preparar los ganglios de la raíz dorsal intactos y realizar un registro de pinzas de parche utilizando esta preparación. Este método permite el registro de una sola célula de los ganglios intactos de la raíz dorsal mientras estimula el nervio espinal entrante o la raíz dorsal saliente. Este enfoque es especialmente útil cuando se estudia la contribución de las neuronas sensoriales primarias al dolor.
La principal ventaja de esta técnica es que mantiene tanto las neuronas como las células gliales satélite adyacentes. Por lo tanto, esta preparación está más cerca de la situación in vivo. En este procedimiento, después de que la rata haya sido anestesiada, afeita su área lumbar.
A continuación, incida la piel y el tejido subcutáneo a lo largo de la línea media. A continuación, separe los músculos periespinales de las apófisis espinosas a nivel L1 a S2 utilizando un elevador perióstico fino. A continuación, corte las apófisis espinosas de L1 a S2. Posteriormente, realice dos cortes transversales en la columna vertebral expuesta aproximadamente en L1 y S1 y retire este segmento de la columna vertebral en bloque.
Luego, sumérjalo rápidamente en un CSF frío durante dos o tres minutos. Después de eso, enjuague la sangre de la columna vertebral extraída y transfiera la columna vertebral a una placa de Petri con aCSF frío, luego use un rongeur fino para eliminar las láminas. Corta la duramadre a lo largo de la línea media con unas tijeras para exponer la médula espinal.
A continuación, transfiera la vértebra restante con DRG a la segunda placa de Petri llena de aCSF frío. Identifique los GRD L4 y L5 en función de su posición relativa con las apófisis transversas y el nervio ciático. Luego, libere el DRG de los tejidos conectivos circundantes y mantenga la raíz nerviosa y el nervio espinal unidos al DRG.
Después de eso, transfiera el DRG a la tercera placa de Petri para una mayor disección. Corta una abertura donde las raíces dorsal y ventral se unen al DRG y separa la raíz ventral de él. Luego, use pinzas con puntas romas para sujetar el epineuro y use otra pinza fina para rodar el DRG desde el epineuro.
Continúe extrayendo la mayor cantidad posible de epineuro que esté adherido al DRG. Ahora, transfiera el DRG a la cámara de grabación. Asegúrese de que el lado del DRG donde se originan las raíces nerviosas esté orientado hacia abajo.
A continuación, estabilice el DRG con un anclaje. A continuación, perfunde el GRD con líquido cefalorraquídeo oxigenado a través de los tubos de plástico conectados con una bomba peristáltica y deja que las células se recuperen durante 30 minutos. Después de 30 minutos, evalúe la calidad de DRG bajo óptica IR-DIC con un aumento de 40x a través de una cámara CCD.
Conectadas individualmente dos jeringas de un mililitro a los soportes de pipetas a través de dos piezas de tubo de goma de pequeño diámetro. A continuación, coloque una pipeta de vidrio llena de colagenasa en uno de los soportes de pipetas y una pipeta de vidrio vacía en el otro. A continuación, utilice el micromanipulador para colocar las pipetas justo encima del DRG.
Golpee suavemente las puntas de dos pipetas entre sí para ampliar las aberturas de las puntas de las pipetas. Después de eso, mueva la pipeta llena de colagenasa cerca de la superficie DRG. Aplique brevemente presión positiva a la pipeta que contiene colagenasa a través del tubo que conecta el soporte y la jeringa desplazando el émbolo unos 0,5 mililitros.
Después de 10 a 15 minutos, cuando se observen los restos del epineuro restante, aplique una suave presión negativa a la pipeta vacía para aspirar los residuos. De esta manera, las neuronas y las células gliales satélite circundantes estarán claramente expuestas y listas para la grabación de parches. En este procedimiento, coloque la solución de electrodo sobre hielo para evitar la degradación.
A continuación, llene la pipeta de parche de vidrio con solución intracelular filtrada. A continuación, coloque la pipeta en el soporte de pipetas de la etapa principal. Aplique una presión positiva suave a la pipeta a través de una jeringa de cinco mililitros desplazando el émbolo aproximadamente un mililitro antes de bajar la pipeta a la solución de baño.
A continuación, elija el modo V-Clamp en el amplificador y abra la interfaz de prueba de membrana en el software. Bajo el microscopio, acerque la pipeta a la neurona objetivo. A continuación, aplique presión positiva desde la pipeta para atravesar la capa de células gliales satélite hasta que se observe un aumento repentino del espacio entre la neurona y la capa circundante de células gliales satélite.
Luego, siga moviendo la pipeta hacia la neurona hasta que se observe un hoyuelo en la neurona. En nuestra preparación, las neuronas están rodeadas de células gliales satélite. Por lo tanto, para penetrar en las capas de células gliales y llegar a las neuronas individuales, la pipeta de registro se mantiene a una alta presión positiva.
Después de eso, reduzca la presión positiva. Logre un sellado de giga-ohmios con una succión suave. Para obtener la configuración de registro de la célula completa, penetre en la membrana de la célula neuronal a través de una succión corta pero fuerte.
Alternativamente, use la función de descarga en el amplificador mientras se aplica la succión. Una vez que se establece un modo de celda completa, compense la capacitancia de toda la celda y la resistencia en serie girando las perillas de compensación de capacitancia y resistencia en el amplificador. A continuación, cierre la ventana de prueba de membrana.
Elija el modo normal I-Clamp girando la perilla de modo en el amplificador. Después, haga clic en Abrir protocolo en el software. Seleccione y cargue el protocolo para medir la reobase y haga clic en grabar para iniciar el registro.
Para examinar la excitabilidad neuronal, mida la resistencia de entrada y la reobase inyectando una serie graduada de corrientes despolarizantes en pasos de 100 picoamperios. A continuación, vuelva a hacer clic en Abrir protocolo y seleccione el protocolo para medir el umbral de membrana. Posteriormente, inyecte una corriente de rampa despolarizadora de 500 milisegundos a la neurona.
Para registrar las corrientes inducidas por el ligando, llene una pipeta con agonistas específicos. Compruebe la pipeta para asegurarse de que no hay burbujas de aire en su interior. A continuación, coloque la pipeta en el soporte de pipetas que está conectado a un sistema de dispensación de medicamentos.
Utilice el manipulador para mover la pipeta a menos de 15 micrómetros de la neurona. Ajuste la presión del sistema de dispensación de medicamentos a un PSI y la duración a un segundo. Luego, cambie el modo de grabación a una pinza de voltaje a 70 milivoltios.
Aplique presión brevemente a través del sistema de dispensación de medicamentos para registrar una corriente inducida por medicamentos. En esta figura, la reobase se midió inyectando una serie de corrientes en la neurona DRG. La intensidad de corriente más baja que puede inducir un potencial de acción se define como reobase, como lo indica la flecha.
La reobase de esta neurona es de 300 picoamperios. El umbral de membrana se midió inyectando una corriente de rampa. El potencial se define como el umbral de membrana cuando se evoca un potencial de acción.
El umbral de membrana para esta neurona es de 11,9 milivoltios. En esta figura, las corrientes fueron inducidas por la aplicación de glutamato o AITC durante un segundo. Ambos agonistas indujeron corrientes internas, lo que sugiere la presencia de receptores de glutamato y receptores TRPA-1 en pequeñas neuronas DRG.
Una vez dominada, esta técnica se puede terminar en una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe extraer el epineuro y mantener la alta presión para la pipeta de registro. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar el registro de pinza de parche en células gliales satélite para responder a preguntas adicionales como receptores y canales en células gliales satélite.
Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo del dolor estudien la contribución de los ganglios de la raíz dorsal a la nocicepción. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un ganglio de raíz dorsal completo y luego cómo parchear la pinza de células individuales en estos ganglios de raíz dorsal completos.
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Visión general
Este manuscrito describe un método para preparar ganglios de la raíz dorsal (DRG) intactos para grabaciones de pinza de parche. Esta técnica preserva el microambiente de las neuronas y las células gliales satélites, minimizando los cambios fenotípicos y funcionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Biología celular
Antecedentes
- Los ganglios de la raíz dorsal contienen neuronas sensoriales primarias y células gliales.
- Mantener los DRG intactos es crucial para estudios fisiológicos precisos.
- Las grabaciones de pinza de parche son esenciales para estudiar la actividad neuronal.
- Los métodos tradicionales pueden alterar el entorno celular.
Propósito del estudio
- Introducir un método para preparar DRG intactos.
- Permitir grabaciones de una sola célula de DRG mientras se estimulan los nervios espinales.
- Estudiar el papel de las neuronas sensoriales primarias en los mecanismos del dolor.
Métodos utilizados
- Anestesia de la rata.
- Preparación del área lumbar para acceder a los DRG.
- Técnicas de grabación de pinza de parche.
- Estimulación de los nervios espinales entrantes o de las raíces dorsales salientes.
Resultados principales
- El método preserva con éxito el microambiente de los DRG.
- Las grabaciones de una sola célula proporcionan información sobre la actividad neuronal.
- Mantener las células gliales mejora la relevancia fisiológica de los hallazgos.
- Este enfoque es beneficioso para la investigación del dolor.
Conclusiones
- Las preparaciones de DRG intactos son superiores para estudios electrofisiológicos.
- El método permite un modelado más preciso de las condiciones in vivo.
- Esta técnica puede avanzar en la comprensión de las funciones de las neuronas sensoriales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Preserving the native microenvironment of dorsal root ganglia neurons and satellite glial cells enables more physiologically relevant electrophysiological data, reducing phenotypic artifacts from dissociation. This approach supports target validation in pain research by maintaining native receptor expression and signaling contexts. It enhances predictive confidence in early discovery by providing a disease-relevant system that mirrors in vivo conditions for mechanistic de-risking of analgesic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by recording from neurons in their native glial microenvironment, preserving functional receptor phenotypes.
- Operational Value: Reduces variability from enzymatic dissociation, improving reproducibility of electrophysiological assays across laboratories.
- Strategic Value: Supports target de-risking by confirming receptor activity (e.g., glutamate, TRPA-1) in a physiologically intact system, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable, reproducible platform for measuring neuronal excitability parameters like rheobase and membrane threshold under controlled conditions.
- Operational Value: Allows rapid preparation (<1 hour) and consistent recovery periods, enabling high-throughput patch clamp workflows.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization for ion channel screening by maintaining satellite glial cell interactions that modulate neuronal responses.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables study of neuron-glia interactions critical to pain pathways, supporting translational biomarker discovery in preclinical models.
- Operational Value: Complements existing preclinical workflows by providing human-relevant electrophysiological readouts from rodent DRG.
- Strategic Value: Improves predictive confidence in lead identification by linking electrophysiological phenotypes to nociceptive mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing electrophysiological confirmation of target engagement in a disease-relevant sensory system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel and receptor function in primary sensory neurons without phenotypic drift from dissociation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible electrophysiological outputs (e.g., rheobase, current amplitudes) for compound effect assessment.
- Analytics: Enables statistical comparison of neuronal excitability and ligand-induced currents across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical pain models by preserving DRG microenvironment relevant to nociceptive signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for multiple target classes in pain and sensory research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity from artificial preparations.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through minimal tissue manipulation and defined recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing false positives in early screening via physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated target engagement in native neuronal contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and tissue handling for intact DRG preparation.
- Dependent on patch clamp amplifiers, micromanipulators, and perfusion systems for stable recordings.
- Necessitates standardization of dissection and recovery protocols across teams to ensure data consistency.
- Adaptation to other ganglia or neural tissues may require optimization of enzymatic and mechanical steps.
- Limited by the need for fresh tissue preparation and skilled operators, affecting scalability to large compound screens.
