El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El objetivo general de estos experimentos es determinar el papel de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer utilizando un modelo singénico del cáncer de mama. Este método puede responder a algunas de las preguntas clave en los campos de la inmunología tumoral y la metástasis del cáncer, como por qué los pulmones son uno de los objetivos más comunes de la metástasis del cáncer hepatógeno. La principal ventaja de este método es que utiliza un modelo de cáncer de mama muy bien establecido con un método muy específico de los micrófagos alveolares pulmioares.

Surya Kumari Vadrevu, investigadora asociada de mi laboratorio, demostrará este procedimiento. El día de la inyección de células tumorales, primero coloque un ratón afeitado y anestesiado en una almohadilla quirúrgica. A continuación, aspire una vez 10 a la quinta célula tumoral en 100 microlitros de PBS en una jeringa de insulina de cinco mililitros de punto cero equipada con una aguja de calibre 29.

Luego use el pulgar y el dedo índice para levantar la piel cerca del segundo y tercer pezón, e inserte la aguja debajo de la piel en la almohadilla de grasa mamaria justo debajo del tercer pezón. Inyecte lentamente las células por vía subcutánea para formar una burbuja debajo de la piel y devuelva al animal a su jaula con monitoreo hasta que se recupere por completo. De cuatro a cinco días después de la inoculación, para medir los tumores, palpar el sitio del tumor y usar un calibrador para usar los diámetros más grandes y más pequeños de los tumores para determinar el volumen tumoral.

Para obtener imágenes de las células 41GFP inyectadas, coloque el ratón anestesiado en una platina móvil dentro del generador de imágenes y obtenga imágenes del sitio del tumor mediante microscopía de fluorescencia. En una cabina de bioseguridad de flujo de aire laminador, seis días después de la inyección de células tumorales, vórtice los liposomas para distribuir uniformemente las partículas y aspire 60 microlitros de la suspensión en una punta de pipeta estéril. Coloque la punta cerca de la fosa nasal del animal anestesiado inoculado al tumor y libere lentamente cinco microlitros de la solución liposómica, permitiendo que el ratón inhale la gota.

Es fundamental administrar la solución liposómica lentamente mientras se mantiene el nivel adecuado de anestesia para permitir que el animal respire regularmente durante el parto. Cuando se hayan administrado los 60 microlitros completos, permita que el ratón se recupere por completo y devuelva al animal a su jaula. Para contar y marcar las metástasis de la superficie pulmonar, coloque los pulmones bajo el microscopio de disección y enfoque el objetivo hasta que se haya obtenido una visión clara de la superficie pulmonar.

A continuación, se cuentan manualmente las metasteses en los lados anterior y posterior de ambos pulmones y se obtienen imágenes de los tumores mediante microscopía de fluorescencia. Después de contar y obtener imágenes de las metástasis, use tijeras quirúrgicas y pinzas para picar el pulmón y transferir los trozos de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene tres mililitros de tampón digestivo. Pruebe los fragmentos en un agitador giratorio en una incubadora a 37 grados centígrados durante 40 minutos y luego tritere la suspensión para disociar el tejido.

A continuación, filtre la suspensión de tejido a través de un colador de 40 micras para eliminar los grumos, presionando las piezas más grandes a través del colador con un émbolo de jeringa según sea necesario. Cuando se haya logrado una suspensión de una sola célula, recoja las células por centrifugación y lise los glóbulos rojos con tampón ACK durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave el pellet dos veces en ocho mililitros de RPMI.

Después de la segunda centrifugación, suspendemos las celdas en tres mililitros de medio RPMI completo para contar, y volvemos a girar las celdas. Ahora diluya las células a una una por 10 a la sexta celda por cada 100 microlitros de concentración de tampón FAX, y transfiera 100 microlitros de elocitas de células a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Recoja las células en el fondo de los pocillos por centrifugación, luego voltee la placa para dejar que el tampón se drene.

Bloquee las celdas con 100 microlitros de CD16 CD32 FC bloquee durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y vuelva a centrifugar la placa. A continuación, voltee la placa para eliminar el sobrenadante, como se acaba de demostrar, y agregue el cóctel de anticuerpos de interés a los pocillos apropiados. Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, granular las células por centrifugación, seguido de un lavado con 200 microlitros de tampón FAX.

A continuación, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de PBS fresco y tiña las muestras con tinte de viabilidad durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las células en otros 200 microlitros de PBS y fijar las muestras en 100 microlitros de paraformaldehído al uno por ciento para almacenarlas a cuatro grados centígrados. Inmediatamente antes de su análisis, transferir las suspensiones celulares a tubos de citometría de flujo de polipropileno.

La inyección de células tumorales 4T1GFP en la almohadilla de grasa mamaria conduce a la formación de tumores de ratón que recapitulan la diseminación metastásica del cáncer de mama humano, como lo demuestran las metástasis de formación rápida observadas dentro de los pulmones. La transfección estable de células 4T1 con GFP facilita el seguimiento de las células tumorales en metástasis y la cuantificación de la carga metastásica. La hastología rutinaria, junto con los algoritmos de patología digital, también proporcionan una buena herramienta para cuantificar y verificar las metástasis.

Además, el análisis de citometría de flujo multicolor permite la caracterización incluso de poblaciones celulares raras, como los macrófagos alveolares CD11b negativos, CD11c F80 positivos. La depleción del biciclonato puede confirmarse por la ausencia de estas células positivas para CD11c F480 en los pulmones disociados de los animales tratados con liposomas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inyectar células tumorales en la almohadilla de grasa mamaria, monitorear el crecimiento tumoral y la metástasis, agotar los macrófagos alveolares y preparar las células pulmonares para el análisis de citometría de flujo.