Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

Presentamos un protocolo para cultivar explantes primarios de ganglios espirales murinos en matrices de electrodos múltiples para estudiar los perfiles de respuesta neuronal y optimizar los parámetros de estimulación. Dichos estudios tienen como objetivo mejorar la interfaz neurona-electrodo de los implantes cocleares para beneficiar la audición de los pacientes, así como el consumo de energía del dispositivo.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo cultivar y registrar la actividad electrofisiológica de las neuronas auditivas en matrices de electrodos múltiples. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación auditiva, como la caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas auditivas y la estimulación por las áreas de electrodos. La principal ventaja de esta técnica es que permite el registro simultáneo extracelular no invasivo de la actividad neuronal de un gran número de neuronas auditivas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia. De hecho, podrían usarse para implementar la interfaz electroneurona de sus prótesis, como el implante coclear, para restaurar la audición en pacientes sordos. Para comenzar este procedimiento, prepare la solución de recubrimiento de ECM descongelando primero la mezcla de ECM en hielo.

A continuación, diluya la mezcla de ECM en un medio de cultivo básico en una proporción de uno a 10 y guárdela en hielo. Para los nuevos MEA en una campana de flujo laminar, sumérjalos en etanol al 70 % durante 30 segundos. Posteriormente, lávalos con agua destilada durante 30 segundos.

A continuación, deje que los MEA se sequen durante 30 minutos. Para recubrir los MEAs, pipetee 50 microlitros de solución de recubrimiento sobre los MEAs con una punta de pipeta fría de 200 microlitros. A continuación, deje reposar los MEA durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente.

Después de eso, retire la solución de recubrimiento. Añadir 100 microlitros de medio de cultivo suplementado con 10%FBS y cinco nanogramos por mililitro de BDNF y dejar a temperatura ambiente hasta el recubrimiento del tejido. A continuación, coloque la placa de Petri que contiene los MEA recubiertos en una placa de Petri grande y agregue una placa de Petri pequeña que contenga PBS para la humidificación.

En este procedimiento, esterilice la cabeza del cachorro con etanol al 70%. A continuación, corta la conexión entre la piel y el cráneo a lo largo de la línea sagital. A continuación, corta el cráneo sagitalmente y retira el cerebro.

Después de eso, corte los huesos temporales del cráneo y colóquelos en una placa de Petri que contenga HBSS estéril y helado. Bajo un microscopio de disección, diseccione la bulla timpánica con un par de pinzas finas y aísle el oído interno. Luego, retira el hueso de la cóclea.

A continuación, retire el ligamento espiral y el SV juntos sujetando la porción basal del ganglio espiral y el SV con pinzas y desenrollando lentamente el SV desde la base hasta el ápice. Separe el órgano de Corti del ganglio espiral en modiolus sosteniendo la porción basal del ganglio espiral y el órgano de Corti con pinzas y desenrollando lentamente el órgano de Corti desde la base hasta el ápice. A continuación, corte los explantes laterales del ganglio espiral con pinzas o tijeras o cuchillos finos de microdisección.

Ahora transfiera los explantes del ganglio espiral y el órgano de Corti al MEA. Luego, coloque los explantes SG sobre el área del electrodo y el órgano de Corti aproximadamente a cinco milímetros del área del electrodo. Coloque los explantes y el órgano de Corti en los MEA evitando dañar el tejido.

Después, coloque los MEA con cuidado en la incubadora y cultive a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Al día siguiente, inspeccione visualmente los explantes para ver si se adhieren a los MEA. A continuación, añadir 100 microlitros de medio de cultivo que contenga un 10% de FBS y BDNF diariamente durante cinco días consecutivos.

En el sexto día, agregue dos mililitros de medio de cultivo que contenga 10% de FBS y cinco nanogramos por mililitro de BDNF y cultive el tejido durante 13 días adicionales. Después de 18 días colectivos de cultivo, lavar el cultivo de MEA con la solución extracelular preparada anteriormente a temperatura ambiente. A continuación, seque los contactos del chip MEA con un trozo de pañuelo y monte los MEA en el soporte MEA.

Por último, instala el MEA en la configuración de grabación. Después, añade 300 microlitros de la solución extracelular y espera 10 minutos para que el sistema se estabilice antes de grabar. Ahora, registre la actividad espontánea durante dos minutos de todos los electrodos e identifique los electrodos activos.

A continuación, identifique los electrodos que responden a la estimulación. Para excluir el artefacto de estimulación, estimule desde el mismo electrodo 10 veces. Si el cultivo responde al menos ocho de cada 10 veces, se puede suponer que es una respuesta positiva a la estimulación inducida por electrodos.

Para identificar un ruido de fondo, aplique TTX al cultivo a una concentración de un micromolar para bloquear los canales de sodio dependientes de voltaje y luego registre durante dos minutos. Aquí están los rastros de las grabaciones originales de seis de los 63 electrodos que muestran actividad espontánea y este es el gráfico ráster de los seis electrodos después de la detección de picos. Cada barra representa un potencial de acción.

Este gráfico ráster incluye todos los electrodos activos. Las actividades se registran desde 63 electrodos durante dos minutos. Esta figura ilustra que se utilizó un estímulo bifásico con una duración total de 80 microsegundos y una amplitud de 80 microamperios para la estimulación del cultivo a partir de un electrodo.

Este ejemplo representativo de trazas de datos en bruto muestra los potenciales de acción, todos sin respuestas después de la estimulación. Y aquí está el cultivo de ganglios en espiral en los MEAs inmunoteñidos para el marcador neuronal, TUJ, al final del experimento para visualizar la cobertura neuronal del área del electrodo. El electrodo utilizado para la estimulación se indica en verde y los electrodos que responden se indican en rojo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 50 minutos si se realiza correctamente. Aunque estos métodos pueden proporcionar información sobre la electrofisiología de las neuronas ganglionares espirales, también se pueden aplicar a otros sistemas, como los cultivos de cerebro o médula espinal. Después del desarrollo, esta técnica allana el camino para los investigadores en el campo de la ciencia de los materiales y la nanotecnología, la modificación rápida de la superficie de la transferencia de electrodos de registro y estimulación neuronal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar y registrar la actividad electrofisiológica, mediante la disposición de un explante de neurona en matrices de electrodos múltiples.