La electroforesis capilar para supervisar Péptido injerto sobre quitosano películas en tiempo real

El objetivo general de este método de electroforesis capilar es monitorear la reacción de injerto de péptidos en películas de quitosano en tiempo real. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química analítica y la química de polímeros, como cómo se está desarrollando la reacción y qué tan eficiente es el proceso de injerto. La principal ventaja de esta técnica es que no es necesaria la preparación de la muestra y la mezcla de reacción se puede analizar en tiempo real.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los procesos de reacción, también se puede aplicar a un sistema, como la unión de un fármaco contra el cáncer a un portador de fármaco, o la digestión de arroz o cereales para el desayuno. Pesa dos gramos de ácido acético glacial y completa hasta 100 mililitros con agua ultrapura. Agregue 100 mililitros de la solución acuosa de ácido acético al 2% en masa a 1,7 gramos de polvo de quitosano.

Revuelva durante cinco días con una barra agitadora y una placa magnética para agitar a temperatura ambiente, ya sea cubierta con papel de aluminio o en la oscuridad. Centrifugar la dispersión de quitosano a 1.076 veces g a 23 grados centígrados durante una hora. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante con una jeringa y deseche el precipitado.

Para cada película, alícuota 10 mililitros de la suspensión de quitosano en una placa de Petri de plástico de nueve centímetros a temperatura ambiente. Deje secar las películas tapadas durante al menos siete días. Con unas tijeras, corte las películas secas en cuadrados de uno por centímetro.

El experimento se puede pausar en esta etapa. Enjuague 10 películas cuadradas de quitosano en cinco mililitros de PBS durante dos horas en una placa de Petri a temperatura ambiente. Durante este tiempo, prepare y valide el instrumento de electroforesis capilar.

Prepare un capilar de sílice fundida desnudo de 43,5 centímetros con un diámetro interno de 50 micrómetros debilitando el recubrimiento exterior de polímero del capilar a la longitud establecida con un utensilio romo y luego rompiendo el capilar. Cree una ventana para el capilar utilizando un encendedor para quemar el recubrimiento de polímero a 8,5 centímetros de la entrada. Después de que el capilar se enfríe, límpielo con etanol.

Luego, quema el recubrimiento del capilar en cada extremo durante unos milímetros con un encendedor. Después de enfriar, límpialo con etanol por segunda vez. Coloque el capilar dentro de la ventana de detección e instálelo en el casete capilar colocándolo a partes iguales en la entrada y salida y enrollándolo alrededor de los husillos del casete.

A continuación, instale el casete en el instrumento de electroforesis capilar. Establezca los parámetros del método para cada separación. En el menú del software, seleccione Método y, a continuación, Editar todo el método.

Seleccione la pestaña CE para editar las condiciones de CE. Ajuste la temperatura, el tiempo, el voltaje y los viales utilizados para la separación. En la sección Preacondicionamiento, establezca las descargas consecutivas.

Use 10 minutos con hidróxido de sodio molar, cinco minutos con hidróxido de sodio 0.1 molar, cinco minutos con agua ultrapura y cinco minutos con tampón de borato de sodio de 75 milimolares a pH 9.2 para el primer método de la secuencia. Compruebe los demás métodos de la secuencia siguiendo el mismo procedimiento. Para los métodos subsiguientes, establezca los lavados consecutivos en la sección Preacondicionamiento en un minuto con un hidróxido de sodio molar y cinco minutos con tampón de borato de sodio de 75 milimolares a pH 9.2.

En la sección Inyección, establezca los parámetros para una inyección hidrodinámica con una presión de 30 milibares durante 10 segundos para todos los métodos. En la sección Separación, establezca las condiciones de separación en 30 kilovoltios, a 25 grados centígrados durante nueve minutos para todos los métodos. Inyecte y separe un patrón interno neutro.

Para el patrón interno neutro, use 10 microlitros de 10% de volumen a volumen DMSO en agua diluida en 450 microlitros de tampón de borato de sodio de 75 milimolares. Antes de iniciar la secuencia, asegúrese de que los parámetros de la secuencia estén configurados en la carpeta y el número de archivo correctos. A continuación, pulse Secuencia para iniciar el experimento.

La separación de los patrones permite la validación del instrumento antes de que se ejecute un experimento. Esto es esencial para el éxito de un experimento. A continuación, inyecte y separe un patrón de oligoacrilato de la misma manera para comprobar la validez del capilar.

Haga una pausa en la secuencia hasta que la reacción de injerto esté lista para comenzar. Para realizar el injerto de RGDS en la película de quitosano, primero pese el péptido y los agentes de acoplamiento. Dos horas después del inicio de la película de quitosano en remojo en PBS, disuelva el péptido y los agentes de acoplamiento en cinco mililitros de PBS.

Tome una alícuota de 50 microlitros de esta solución y agregue dos microlitros de 10% de volumen a volumen DMSO en agua como estándar neutro interno. Analice la alícuota con electroforesis capilar utilizando las mismas condiciones de análisis que antes. A continuación, retire el PBS utilizado para enjuagar las películas de quitosano de la placa de Petri.

Agregue la solución de cinco mililitros de péptido y agentes de acoplamiento a la placa de Petri que contiene las películas de quitosano. Cubra la placa de Petri con una película de parafina y colóquela en un agitador orbital a temperatura ambiente. Tome 50 alícuotas de microlitros de medio de reacción a tiempos establecidos.

Las alícuotas tomadas del medio de reacción deben analizarse inmediatamente. Se deben tomar las medidas adecuadas en rápida sucesión para permitir el análisis en tiempo real. Agregue dos microlitros de 10% de volumen al volumen DMSO en agua como un estándar neutro interno a cada alícuota.

Analice las alícuotas con electroforesis capilar tan pronto como se tomen. Una vez finalizadas las separaciones, enjuague el capilar con agua ultrapura durante 10 minutos. Después de cuatro horas de agitación y eliminación de alícuotas, retire la placa de Petri del agitador.

Después de quitar el medio de reacción de la placa de Petri, agregue cinco mililitros de PBS para enjuagar las películas de quitosano. Retire el PBS de la placa de Petri, enjuague las películas de quitosano con agua ultrapura y déjelas secar durante la noche. Guarde las películas a menos 20 grados centígrados en una placa de Petri de plástico.

Los resultados representativos de la primera alícuota de la reacción química muestran una separación de los diferentes reactivos químicos. El pico del péptido RGDS en este momento es el punto de partida de la reacción y se puede utilizar para cuantificar la eficiencia del injerto. A medida que la reacción del injerto se monitorea continuamente, el área del pico RGDS continúa disminuyendo hasta que permanece constante, lo que significa el final del experimento.

Un segundo pico a la derecha del pico de HCl de EDC aparece como se espera cuando se produce la reacción. Una integración del pico de RGDS a lo largo del tiempo permite calcular el consumo de péptidos. La espectroscopia de RMN en estado hinchado de películas de quitosano en PBS permite la detección del injerto de RGDS, película de quitosano y película de quitosano injertada con el péptido RGDS, o hinchada en PBS.

El asterisco representa las señales asignadas a RGDS. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar todas las soluciones con anticipación.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la espectroscopia de animales de estado sólido para responder a preguntas adicionales, como la validación directa de los experimentos de graficación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la electroforesis capilar de solución libre en el monitoreo de reacciones químicas.