Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas

El objetivo general de este procedimiento es fabricar nanopartículas de seda a partir de una solución acuosa de seda mediante ingeniería inversa y, posteriormente, utilizar estas nanopartículas de seda para aplicaciones de administración de fármacos. Por lo tanto, este método utilizó la nanoprecipitación para generar partículas a base de seda, que se pueden utilizar para una amplia gama de aplicaciones, como la administración de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es la simplicidad y la reproducibilidad para obtener nanopartículas de seda uniformes, estables y de distribución lateral.

Para comenzar este procedimiento, ponga a hervir dos litros de agua destilada. Luego, agregue con cuidado 4,24 gramos de carbonato de sodio. A continuación, use unas tijeras para cortar cinco gramos de capullos secos en trozos de cinco milímetros por cinco milímetros.

Agregue los trozos de capullo a la solución de carbonato de sodio y hierva durante 60 minutos para desgomar las fibras de seda, revolviendo ocasionalmente. Una vez que se complete la ebullición, retire la seda desgomada. Lavar con un litro de agua destilada durante 20 minutos, tres veces.

Luego, exprima la seda lavada para eliminar el exceso de líquido, desate la seda con la mano y colóquela en una campana extractora para que se seque al aire durante la noche. Una vez completado el secado, empaque herméticamente cinco gramos de fibras de seda secadas al aire en el fondo de un vaso de precipitados de 50 mililitros. A continuación, prepare una solución fresca de 9,3 molares de bromuro de litio.

Disuelva la seda en bromuro de litio, agregando cuatro mililitros de bromuro de litio por gramo de seda. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio para evitar la evaporación. Deje que la seda se disuelva durante cuatro horas a 60 grados centígrados, revolviendo ocasionalmente.

Una vez completada la disolución, humedezca un casete de diálisis en agua durante cinco minutos. Luego, transfiera 15 mililitros de la solución de bromuro de seda y litio al casete de diálisis. Use una aguja y una jeringa para eliminar las burbujas de aire.

Diálisis contra un litro de agua destilada. Cambie el agua a la una, tres y seis horas. Cambie el vaso de precipitados por agua nueva a la mañana y a la noche siguientes, y una última vez en la mañana del tercer día.

Una vez finalizada la diálisis, recoja la solución de seda del casete y centrifuga a 9.500 veces g durante 20 minutos a cinco grados centígrados. Recuperar el sobrenadante y repetir la centrifugación dos veces más. Luego, retire, seque y determine el peso seco total y la concentración de la solución de seda como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, agregue una solución de seda de 5% de peso por volumen gota a gota a acetona, manteniendo la concentración de volumen por volumen de acetona por encima de 75. Llene los tubos por completo para asegurarse de que no colapsen durante la centrifugación. Centrifugar el precipitado a 48.000 veces g durante dos horas a cuatro grados centígrados.

Desaloje el pellet con una espátula y agregue 20 mililitros de agua destilada. Utilice las puntas de pipeta para retirar el pellet de la espátula y vórtelo durante 20 segundos. A continuación, sonique el pellet con una sonda ultrasónica al 30% de amplitud durante 30 segundos, dos veces.

Una vez completada la sonicación, rellene el tubo de centrífuga hasta su capacidad con agua destilada. Repita la centrifugación y la resuspensión al menos dos veces más. Luego, almacene a cuatro grados centígrados para uso futuro.

Comience preparando una solución de doxorrubicina como se describe en el protocolo de texto. A continuación, mezcla dos mililitros de una solución de doxorrubicina de 0,2 micromoles por mililitro con 200 microlitros de nanopartículas de seda a 10, 30 o 50 miligramos por mililitro en un tubo de dos mililitros. Incube la suspensión de seda-doxorrubicina a temperatura ambiente durante la noche en un mezclador giratorio.

Una vez completada la carga del fármaco, centrifugar la suspensión a 194.000 veces g durante 30 minutos. Lave las nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina con agua destilada y repita la centrifugación dos veces. A continuación, tire del sobrenadante y anote el volumen total.

Pipetear 200 microlitros del sobrenadante en una placa de microtitulación negra. Usando un lector de microplacas de fluorescencia, establezca la longitud de onda de excitación en 485 nanómetros y la longitud de onda de emisión en 590 nanómetros, y registre los valores de fluorescencia. Después de cultivar y sembrar células MDA-MB-231, agregue doxorrubicina de difusión libre, nanopartículas de seda y nanopartículas de seda cargadas con doxorrubicina en la placa respectiva de 96 pocillos.

A continuación, se añade MTT a las 72 horas para determinar la viabilidad celular y la concentración inhibitoria semimáxima. Incubar durante cinco horas. Una vez completada la incubación, drene cuidadosamente los pocillos con una pipeta.

Agregue 100 microlitros de dimetilsulfóxido para disolver el formazano. Usando un lector de microplacas de absorbancia, mida la absorbancia a 560 nanómetros. Reúna estos datos para tres experimentos independientes.

En este procedimiento, se fabrican nanopartículas de seda a partir de capullos de Bombyx mori. La doxorrubicina se utiliza como un fármaco modelo quimioteropatico clínicamente relevante para estudios de carga de fármaco y citotoxicidad in vitro. Los resultados representativos de la eficiencia de encapsulación de doxorrubicina para 2, 6 y 10 miligramos de nanopartículas de seda se pueden ver aquí.

La capacidad de las nanopartículas de seda cargadas con fármacos para administrar doxorrubicina y, posteriormente, matar las células cancerosas se evalúa in vitro con células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano. A dosis equivalentes de fármaco de 0,1 microgramos, la doxorrubicina libremente difundible y las partículas de seda cargadas de doxorrubicina causan disminuciones significativas en la viabilidad celular. La doxorrubicina libremente difundible muestra una mayor citotoxicidad que las nanopartículas de seda cargadas debido a las diferencias en la absorción celular.

Las mediciones cuantitativas se corroboran mediante imágenes cualitativas de microscopio electrónico de barrido. Los cultivos control muestran una mayor densidad celular y un fenotipo mesenquimal predominante. Resultados similares se observan en cultivos expuestos a nanopartículas de seda.

Los cultivos expuestos a doxorrubicina muestran un fenotipo marcadamente diferente, con una morfología amplia y dispersa. La exposición a doxorrubicina libremente difundible o a nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina da como resultado una reducción sustancial del número de células. Por lo tanto, un maestro entrega una solución de seda de ingeniería, que se puede entregar en tres días.

Y una nanopartícula de seda se puede fabricar en un día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar una centrífuga resistente a la acetona para asegurar la nanoprecipitación y el análisis de la muestra. Además, asegúrese de que el tubo de centrífuga esté completamente lleno para que no colapse durante la centrifugación.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar una solución de seda de ingeniería inversa y usarla para generar la nanopartícula de seda uniforme con una distribución de lado estrecho.