Síntesis y caracterización de un profármaco Aspirina-fumarato que inhibe la actividad de NFkB y de la mama células madre del cáncer

Los objetivos generales de este procedimiento son demostrar cómo se sintetiza el profármaco antiinflamatorio aspirina-fumarato GTCpFE y cómo mejora la actividad de las células madre anti-NFkappaB y anticancerosas en las células de cáncer de mama. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapéutica del cáncer al mostrar cómo podemos reutilizar o incluso mejorar los medicamentos antiinflamatorios para dirigirse a las células madre del cáncer de mama resistentes a la terapia. La principal ventaja de esta técnica es que utilizamos el enfoque multidisciplinario para obtener y caracterizar el profármaco aspirina-fumarato mejorado.

Loruhama Delgado-Rivera, estudiante graduada en el laboratorio del Dr. Gregory Thatcher, demostrará la síntesis del profármaco aspirina-fumarato GTCpFE. Mientras que la actividad anti-NFkappaB de GTCpFE en células de cáncer de mama será demostrada por Gergana Georgieva, estudiante de farmacia investigadora en el laboratorio de la Dra. Jonna Frasor. Con una jeringa de émbolo de plástico, mida 0,81 mililitros de metanol y mézclelo con 10 mililitros de agua en un matraz de fondo redondo.

Enfríe la mezcla resultante a cero grados centígrados colocando el matraz en un baño de agua helada. Agregue 2,48 miligramos de alcohol 4-hidroxibencílico a la mezcla de reacción. Revuelva hasta que la solución esté clara.

A continuación, prepare una solución de cloruro de O-acetilsalicililoilo en tolueno anhidro disolviendo el soluto en el disolvente en un matraz separado. Con una jeringa de émbolo de plástico, agregue esta solución a la mezcla de alcohol 4-hidroxibencílico y deje la reacción agitando a cero grados centígrados. Monitoree la reacción mediante cromatografía de capa fina, o TLC, como se describe en el protocolo de texto.

Cuando se complete la reacción, retire el baño de agua helada y deje que la reacción se revuelva a temperatura ambiente durante 20 horas. Filtrar el precipitado utilizando un embudo Buchner con un disco fritado de porosidad media. Luego, coloque el sólido en un vial de centelleo y deje el compuesto en el vacío durante la noche en un desecador a temperatura ambiente.

A continuación, selle un matraz de fondo redondo completamente seco con un tabique y perfore con una aguja que esté conectada a un sistema de bomba de vacío. Infle un globo con gas argón y conéctelo a una jeringa de plástico con una aguja. Inserte la aguja conectada al globo de argón a través del tabique, sellando el matraz de fondo redondo, y retire la aguja conectada a la bomba de vacío.

A continuación, añada el éster de 4-hidroximetil-fenilo, de ácido 2-acetiloxibenzoico, 4-dimetilaminopiridina y trimetilamina en un matraz separado. Disuelva los productos químicos en cinco mililitros de tetrahidrofurano anhidro. Con una jeringa de plástico conectada a una aguja, agregue la solución al matraz sellado de fondo redondo.

Enfríe la mezcla hasta cero grados centígrados colocando el matraz en un baño de agua helada. A la mezcla anterior, agregue una solución de cloruro de fumaroil de etilo y tetrahidrofurano anhidro gota a gota durante un período de 10 minutos. Revuelva la mezcla resultante durante dos a cuatro horas, monitoreando la reacción por TLC como se describe en el protocolo.

Extraiga la mezcla de reacción añadiéndola a un embudo separador junto con 100 mililitros de acetato de etilo y 50 mililitros de salmuera. Tapa el embudo y agítalo vigorosamente. Inclinando el embudo hacia el lado de la tapa, abra lentamente la válvula para permitir que escape el aire.

Una vez finalizada la extracción, retire la fase acuosa y repita la extracción dos veces más. Después de eliminar la fase acuosa, seque la mezcla agregando sulfato de sodio a la fase orgánica hasta que el sólido no se aglomere cuando se agite la cristalería. Usando otro embudo Buchner con un disco fritado, filtre la mezcla a un matraz de fondo redondo para eliminar el sulfato de sodio.

Luego, evapore hasta la sequedad usando un evaporador rotativo con la temperatura establecida en 40 grados centígrados. A continuación, prepare una columna con gel de sílice y la fase disolvente adecuada. Una vez que se haya agregado el compuesto, agregue una capa de sulfato de sodio para proteger la columna a medida que se agrega el solvente.

A medida que se ejecuta la columna, controle el eluido mediante TLC. Localice todos los demás tubos de ensayo a medida que se recogen de la columna. Cuando el producto de interés se diluya, mezcle todas las muestras que contengan producto puro en un matraz grande de fondo redondo.

Seque los productos utilizando un evaporador rotativo con la temperatura del baño ajustada a 40 grados centígrados. Realice un cultivo celular y transfecte las células con ADN para el ensayo reportero de luciferasa del elemento de respuesta NFkappaB como se describe en el protocolo de texto. A continuación, disuelva las soluciones madre del GTCpFE o de los fármacos aspirina en dimetilsulfóxido a una concentración de 1000x.

Después de 16 horas de transfección y 1 microlitro de vehículo o diferentes soluciones madre de fármaco a cada pocillo. Después de agregar los medicamentos, incubar las células durante dos horas a 37 grados centígrados. Para activar la vía NFkappaB, en la citocina proinflamatoria, TNFalpha, en cada pocillo para una concentración final de 10 nanogramos por mililitro.

También incluye un control de TNFalpha solo. Después de incubar las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados, aspire el medio. Almacene las celdas a menos 80 grados centígrados.

Mida la luciferasa usando un sistema de ensayo indicador de luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para realizar el ensayo de mamósfera, primero prepare el medio de mamosfera como se describe en el protocolo de texto. A continuación, prepare las células individuales de la línea celular MDA-MB-231 mediante la digestión con tripsina de cultivos monocapa y filtre a través de tamices de malla.

Después de contar manualmente las celdas disociadas individuales, póngalas en placas de fijación ultra baja de 96 pocillos a una densidad de 400 celdas por pocillo. Luego coloque las celdas en la incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue diferentes concentraciones de GTCpFE hasta un volumen final de 100 microlitros.

Llevar a cabo todos los tratamientos por triplicado. Después de siete días de cultivo en la incubadora a 37 grados centígrados, adquiera imágenes a través de un software de imágenes con un microscopio invertido. Cuente manualmente el número de mamósferas de más de 75 micras de diámetro.

Para medir el inmunofenotipo de células madre cancerosas CD44 alto y CD24 bajo, tripsonice las células MDA-MB-231 con tripsina al 0,25% durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Después de contar las células con un hemocitómetro, siembre las células en tres millones de células por plato en 10 mililitros de medio como se describe en el protocolo de texto. A continuación, añada vehículo o GTCpFE a las células e incube a 37 grados centígrados durante 72 horas.

Después de la incubación, tripsinar las células y distribuir un millón de células tripsinizadas en tubos de poliestireno de cinco mililitros. Los tubos deben contener dos mililitros de tampón HBSS 1x suplementado con 2% de FBS y estar etiquetados como prueba o control. Para teñir el marcador de superficie CD44 y CD24, gire las células hacia abajo, aspire el tampón, luego agregue 20 microlitros de cada anticuerpo conjugado y 80 microlitros del tampón HBSS a los tubos de ensayo para un volumen final de 100 microlitros.

A continuación, agregue 100 microlitros del mismo tampón a los tubos de control. También se incluyen los controles de tinción única de anticuerpos conjugados CD44 APC y anticuerpos CD24 PE o los controles de inmunotipo ITG. Incuba las células en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Centrifugar las células durante cinco minutos a 400 veces g y reconstituirlas en 200 microlitros de tampón. Mantenga las celdas en hielo y en la oscuridad. Ahora se puede realizar el análisis FACS.

GTCpFE inhibe la actividad de la luciferasa NFkappaB-RE y la expresión de los genes diana de NFkappaB, como la molécula de adhesión intercelular 1, el ligando 2 del motivo C-C de quimiocinas y el factor de necrosis tumoral en células de cáncer de mama MCF-7. La concentración inhibitoria calculada al 50% de ambos criterios de valoración es de aproximadamente 20 micromolares de GTCpFE. En comparación, la aspirina de 200 micromolares no muestra actividad inhibitoria en las células de cáncer de mama.

Esto indica que la estrategia profármaco de añadir el fumarato farmacológico a la aspirina mejora significativamente su actividad anti-NFkappaB. GTCpFE inhibe la formación de células de cáncer de mama MDA-MB-231 en la mamósfera de forma dependiente de la dosis. De manera similar a la inhibición de la vía NFkappaB en cultivos adherentes, el valor de IC50 para la formación de mamosfera es de aproximadamente 20 micromolares.

También se midió la población de células que expresan el inmunofenotipo CD44 alto y CD24 bajo, que es un marcador de superficie de células madre cancerosas de buena fe en el cáncer de mama. El tratamiento con GTCpFE dio lugar a un agotamiento significativo de la población de CD44 alta y CD24 baja en las células MDA-MB-231. En conjunto, estos resultados establecen la capacidad de GTCpFE para dirigirse eficazmente a las células madre del cáncer de mama.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo se diseña y sintetiza el profármaco fumarato de aspirina y cómo caracterizar su actividad anti-NFkappaB y anticancerosa de células madre en las células de cáncer de mama. Tuvimos la idea de este método cuando la aspirina no logró inhibir la vía NFkappaB en las células de cáncer de mama, como se informó anteriormente en la literatura. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia con células madre anticancerosas, porque demostramos que al dirigirnos a múltiples vías proinflamatorias podemos, de hecho, erradicar eficazmente las células madre del cáncer de mama.

Aunque este método puede proporcionar información sobre cómo diseñar, sintetizar y caracterizar agentes antiinflamatorios en el cáncer de mama, se puede aplicar a otras neoplasias malignas en las que múltiples vías proinflamatorias están activas y contribuyen a la patología de la enfermedad. Después de este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el ensayo de aldeflúor y la tumorigénesis in vivo, para evaluar el efecto del fármaco en las células madre del cáncer de mama. La técnica puede allanar el camino para que los investigadores en terapias contra el cáncer exploren el diseño de agentes antiinflamatorios a favor.

GTCpFE puede servir como prototipo para el desarrollo de nuevos agentes antiinflamatorios basados en fumarato y aspirina. Y esto también podría ser la base de una nueva clase de agentes de células madre anticancerígenas.