Análisis espacio-temporal de cytokinetic Eventos en la levadura de fisión

El objetivo general de esta técnica de microscopía de células vivas es estudiar los eventos espacio-temporales que ocurren durante la citocinesis en el sistema modelo de levadura de fisión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo citocinético, como los detalles moleculares de las diferentes etapas de la citocinesis a lo largo del tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que los diferentes componentes espaciales de la maquinaria citocinética pueden ser analizados durante largos períodos de tiempo con una toxicidad mínima para las células.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la citocinesis y la levadura de fisión, también se puede aplicar a la levadura en ciernes y otros hongos. Para comenzar este procedimiento, vierta de tres a cuatro mililitros de medio derretido mezclado con vitamina C en una placa de cultivo con fondo de vidrio. Una vez que el medio se haya solidificado, utilice un bisturí afilado para levantar suavemente la losa de medio de la placa de cultivo y coloque una punta de pipeta entre la losa de medio y la placa de cultivo para evitar que la losa vuelva a caer en la placa.

A continuación, cargue de dos a cinco microlitros de cultivo celular resuspendido entre la losa de medio y el fondo de vidrio de la placa de cultivo. A continuación, retire muy suavemente la punta de la pipeta y vuelva a colocar la losa de medios en su posición original en la placa de cultivo. Incubar las células en la placa de cultivo durante 30 minutos a una hora en la oscuridad a la temperatura a la que se realizará la microscopía.

Cuando las células estén listas para la toma de imágenes, coloque una gota de silvestre en el lado exterior del vaso de la placa de cultivo. Coloque la placa de cultivo en un microscopio invertido. Concéntrese en el plano medial de las células y asegúrese de que estén bien espaciadas y no demasiado abarrotadas.

Asegúrese de iniciar la adquisición de imágenes de las células en una etapa adecuada del ciclo celular. En este experimento, es G2 tardío. A continuación, programe el software de adquisición de imágenes. Establezca el tiempo de exposición para DIC en 100 milisegundos.

Para los filtros GFP y RFP, utilice tiempos de exposición de 75 milisegundos. Ajuste la potencia del láser al 50%, pero tenga en cuenta que esto variará según el experimento individual. Para capturar imágenes en tres dimensiones, programe el software para adquirir la serie Z.

Uso de un tamaño de paso máximo de 4 micrómetros y una distancia de 3,0 micrómetros alrededor del punto de enfoque central de las celdas para la captura de 16 tramas Z por punto de tiempo para la distancia Z total de 6 micrómetros. Estos parámetros se pueden modificar de acuerdo con el grosor de la celda. Configure el programa para tomar imágenes cada dos minutos.

Seleccione el tiempo de exposición en función de los requisitos del experimento. En este ejemplo, se utilizan 75 milisegundos. Programe el software para que detenga la adquisición después de 90 minutos.

Y luego inicie la adquisición de la imagen. El software ImageJ se utiliza para analizar la imagen. Para comenzar, abra la serie de imágenes para cada una de las longitudes de onda.

Seleccione la célula que se va a estudiar. Haga doble clic en la opción de línea de la barra de herramientas para abrir otra ventana y ajustar el ancho de línea. Ajuste el ancho de línea para que corresponda al ancho de la celda, que es de aproximadamente 40 a 50 píxeles para una celda de tipo salvaje.

Dibuja una línea a lo largo del eje largo de la celda de interés. Haga clic en analizar, luego en herramientas, luego en administrador de ROI y luego haga clic en agregar. Esto agregará la línea seleccionada a la ventana de ROI para su uso posterior.

No cierre esta ventana. Haga clic en la imagen de interés, luego seleccione editar, luego seleccionar y luego enderezar. Verifique el proceso de toda la pila para enderezar la celda horizontalmente.

Haga clic en la imagen, luego transforme y luego gire 90 grados a la derecha para enderezar la imagen verticalmente. Haga clic en la imagen, luego apila y luego haga el montaje. Esto abrirá una ventana para asignar el número de filas y columnas para la pila, el factor de escala para el tamaño de la imagen, el primer y último corte o fotograma para el montaje, y el incremento de fotograma para el montaje.

Verifique las porciones de etiquetas y presione enter. Como se muestra una ventana con un montaje de la celda de interés, abra la serie de imágenes para la otra longitud de onda. En el administrador de ROI, haga clic en el identificador de línea para seleccionar la misma celda en el segundo archivo de imagen.

Repita los pasos anteriores para abrir un montaje de la segunda imagen. En la imagen con el marcador de cuerpo de poste de husillo, Sad1-mCherry, busque la separación del marcador de cuerpo de poste de husillo y marque ese punto de tiempo como tiempo cero. Siga la señal de la proteína del anillo Rlc1-tomate en la imagen a lo largo del tiempo y busque la señal que aparece como una línea distinta en lugar de los parches de Rlc1-tomate.

Este punto de tiempo marca la finalización del ensamblaje del anillo de actomiosina o el inicio de la fase de maduración. A continuación, desplácese por la película a lo largo del tiempo para determinar cuándo el anillo de tomate Rlc1 comienza a disminuir de tamaño. Esto se marca como el final de la fase de maduración o el inicio de la constricción del anillo.

Siga la señal de tomate Rlc1 a lo largo del tiempo a lo largo de la constricción hasta que aparezca como un punto en el centro del eje de la celda. Esto se marca como el final de la constricción del anillo o el final de la entrada del tabique. Después del montaje de las imágenes DIC, determine cuándo se completa la abscisión.

Registre el momento en que las celdas se separan físicamente. Comience este análisis seleccionando una célula con un anillo de actomiosina visible. Haga doble clic en la opción de línea de la barra de herramientas de ImageJ.

Ajuste el ancho de línea para que corresponda al grosor del anillo, aproximadamente de 15 a 20 píxeles. Dibuja una línea a lo largo del anillo, teniendo cuidado de asegurarte de que se incluya todo el grosor del anillo. Haga clic en analizar, luego en herramientas, luego en Administrador de ROI y haga clic en agregar.

Esto agregará la línea de selección a la ventana de ROI para su uso posterior. No cierre esta ventana. Haga clic en la imagen de interés y seleccione editar, luego seleccionar, luego enderezar.

Verifique el proceso de toda la pila para enderezar el anillo horizontalmente. Restablece la intensidad del plano más brillante de la pila Z de enderezamiento mediante la imagen, luego ajusta, luego el brillo y el contraste, luego restablece. Haga clic en la pestaña SGK y luego en Proyecto 3D para abrir un cuadro de diálogo.

Cambie el método de proyección al punto más brillante y el espaciado de corte a dos o tres píxeles. Finalmente, cambie el eje de rotación al eje X o Y según el ángulo de visión deseado. Haga clic en interpolar y haga clic en Aceptar para generar una proyección 3D de la imagen.

Use la barra de desplazamiento debajo de la imagen para rotarla. A continuación, abra la serie de imágenes para la otra longitud de onda. Haga clic en el identificador de línea en el administrador de ROI para seleccionar el mismo anillo en el segundo archivo de imagen.

Repita los pasos anteriores para abrir un anillo 3D en la imagen con la otra longitud de onda. Con ambos anillos de imagen 3D abiertos, haga clic en la imagen, luego en el color y luego en la combinación de canales. Seleccione cada imagen del menú desplegable para el color correspondiente deseado y haga clic en Aceptar. Comparar la localización de diferentes marcadores con respecto a la localización en el anillo citocinético o en la membrana de ingreso.

Durante la citocinesis, se tomaron imágenes de células de levadura de fisión expresadas en el marcador corporal del polo del huso, Sad1-mCherry y el marcador de anillo Rlc1-GFP. La separación del cuerpo del polo del huso se produjo a los 17 minutos, designado como tiempo cero. Rlc1-GFP aparece en el sitio de división cuatro minutos antes de la separación del cuerpo del polo del huso.

Después de la separación del cuerpo del polo del husillo, la maduración del anillo comienza a los diez minutos. La constricción del anillo comienza a los 31 minutos y termina a los 53 minutos. Finalmente, la abscisión celular ocurre a los 80 minutos después de la separación del cuerpo del polo del huso.

La línea de tiempo de los eventos citocinéticos determinados en las imágenes anteriores se puede trazar en un gráfico con referencia a la mitosis determinada por la distancia entre los marcadores del cuerpo del polo del huso. El análisis del marcador de anillo Rlc1-tomate y el marcador de membrana del tabique Bgs1-GFP en el sitio de división durante la citocinesis revela que el anillo se ensambló antes del reclutamiento de Bgs1-GFP. A medida que el anillo se contrae, Bgs1-GFP también se localiza en la membrana de ingreso adyacente al anillo de constricción.

Finalmente, la señal de Rlc1-tomate se disipa después de la constricción del anillo, mientras que Bgs1-GFP aparece como un disco, permaneciendo dentro de la barrera de membrana. La eficiencia de los eventos citocinéticos se puede determinar por la distribución de las proteínas a lo largo del anillo. Aquí, la distribución de Cdc15-GFP a lo largo del anillo es uniforme en la imagen de la izquierda, pero desigual en la imagen de la derecha.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar elegir celdas con un campo apropiado, idealmente que contengan de seis a ocho celdas bien espaciadas a finales de la fase G2 o M temprana, sin impurezas visibles en el agar. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar espacio-temporalmente la localización de proteínas durante la citocinesis.