RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

El objetivo general de este procedimiento es aislar células individuales marcadas con fluorescencia de retinas vivas de montaje completo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia. Por ejemplo, ¿cuántos subtipos de una clase neuronal en particular existen y cuáles son los marcadores genéticos para cada subtipo?

La principal ventaja de esta técnica es que renunciamos a la necesidad de disociar el tejido de la retina, lo que permite que las células sobrevivan en un entorno más saludable antes del aislamiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden a cualquier población celular marcada con fluorescencia y, por lo tanto, se pueden aplicar a otros sistemas para comprender la diversidad celular y la función en la salud y la enfermedad. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque esta técnica se basa en la capacidad del investigador para sujetar una célula sin comprometer la viabilidad de la célula.

La demostración futura de este método es fundamental, ya que los pasos de aislamiento de ARN pueden ser difíciles de aprender, ya que la pequeña cantidad de ARN puede degradarse fácilmente si no se maneja de manera adecuada y rápida. Para comenzar este procedimiento, pinche la córnea con una aguja y córtela en el borde de la córnea y la esclerótica. Luego, retire la lente con pinzas.

Haga suavemente un desgarro en la esclerótica y corte el nervio óptico donde se unen la retina y la esclerótica. Termine con cuidado de retirar la esclerótica de la retina. A continuación, retira el vítreo transparente.

Cortar las retinas por la mitad y guardarlas en la solución extracelular oxigenada a temperatura ambiente hasta su uso. Cuando esté listo para montar el tejido en la cámara de registro, transfiera un trozo de retina a la solución enzimática, diluido en 500 microlitros de solución extracelular oxigenada en una placa de Petri, e incube durante dos minutos a temperatura ambiente en un agitador. Posteriormente, lavar la retina en la solución extracelular oxigenada y transferirla a una cámara de registro con fondo de vidrio con una pipeta de transferencia de plástico.

Después de eso, use fórceps para aplanar cuidadosamente el tejido con la capa fotorreceptora hacia abajo. Retire el exceso de líquido con una pipeta y ancle el tejido con un anillo de platino con malla de nylon. A continuación, llene la cámara con la solución extracelular oxigenada y móntela en una platina de microscopio.

Perfundir el tejido con la solución extracelular oxigenada a una velocidad de dos a cuatro mililitros por minuto. Para prepararse para este procedimiento, pulse algunas micropipetas de vidrio para registros electrofisiológicos con un extractor de micropipetas. Observe la capa de células ganglionares utilizando la óptica IR-DIC.

A continuación, identifique las células ganglionares GFP más mediante epifluorescencia a unos 480 nanómetros. A continuación, localice la pipeta llena de solución intracelular en DIC. Aplique una ligera presión positiva y ponga a cero cualquier compensación de voltaje en el amplificador.

A continuación, baje la micropipeta de vidrio en una celda positiva GFP y aplique los pasos de comando de voltaje de prueba para monitorear la resistencia del sellado. La presión negativa debe formar un sello de gigaohmios entre la pipeta y la membrana celular. Después de formar un sello estable, rompa la membrana aplicando breves pulsos de presión negativa para obtener acceso a toda la célula.

Espere uno o dos minutos para que las dendritas de la célula se llenen de trazador fluorescente. En este paso, extraiga cuidadosamente el contenido citoplasmático de la célula en la pipeta aplicando presión negativa con una jeringa de diez mililitros. Mientras tanto, monitoree la extracción en DIC visualizando el cuerpo celular disminuyendo de tamaño.

Después de extraer el contenido citoplasmático, levante la pipeta con cuidado del tejido y retire rápidamente la pipeta de la solución. A continuación, retire rápidamente la pipeta del soporte de la cabecera y enjuague brevemente la punta de la pipeta con H2O tratado con DEPC. A continuación, conecte la pipeta a una jeringa de un mililitro a través del tubo hermético.

Expulse inmediatamente las células en diez microlitros de tampón de lisis, uno en los tubos de PCR de 0,2 mililitros. Centrifugar brevemente los tubos en una mini centrífuga de mesa a 2000 veces g durante diez segundos. A continuación, congele inmediatamente las muestras en hielo seco durante cinco minutos.

Después de congelarlos, guárdelos a menos 80 grados centígrados durante un máximo de dos semanas para obtener mejores resultados. Para prepararse para este procedimiento, configure un dispositivo separador magnético pegando la parte superior de un soporte de punta P20 o P200 invertido al soporte magnético de 96 pocillos. Luego, prepare etanol fresco al 70% a aproximadamente un mililitro por muestra.

Retire las perlas magnéticas de ARN del almacenamiento a 4 grados C y descongélelas a temperatura ambiente. Una vez que las perlas de ARN estén a temperatura ambiente, póngalas en vórtice durante 30 segundos para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Después de eso, descongele las células a temperatura ambiente durante un minuto.

A continuación, añada cinco microlitros de H2O sin arnana a cada muestra y pipetee hacia arriba y hacia abajo. Después, añade 22 microlitros de perlas de ARN a cada tubo y mezcla bien. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos para permitir que el ARN interactúe y se una a las perlas magnéticas.

Después de eso, coloque los tubos en un dispositivo separador magnético durante ocho minutos. Antes de continuar, asegúrese de que el sobrenadante esté limpio. Observe las cuentas de una paleta y asegúrese de no separarla del costado del tubo durante el pipeteo.

Retire el sobrenadante de las muestras y agregue 150 microlitros de etanol al 70%. Luego, retire el etanol y repita el lavado dos veces más. Deje que las muestras se sequen al aire durante seis minutos.

Verifique intermitentemente si se ha recolectado más etanol en el fondo del tubo y retírelo en consecuencia. Recuerde que es fundamental secar las cuentas adecuadamente. Si las perlas no están lo suficientemente secas, el etanol puede ser arrastrado a través del eluyente y disminuirá los rendimientos totales, mientras que las perlas demasiado secas pueden resultar en la pérdida de ARN.

Mientras se secan las muestras, prepare un tampón de reacción 10x combinando 19 microlitros de tampón de lisis dos y un microlitro de inhibidor de Rnasa. Gírelo brevemente y manténgalo en hielo. Una vez que las muestras estén secas y los gránulos de perlas ya no parezcan brillantes, retire los tubos del separador magnético y agregue 9,5 microlitros de H2O sin ARNasa para rehidratar las muestras.

A continuación, coloque las muestras en hielo y añada un microlitro de tampón de reacción 10x a cada muestra. Esta imagen muestra la capa de células ganglionares de la retina, visualizada mediante IR-DIC en toda la preparación de la retina montada. La misma preparación se visualizó en epifluorescencia a unos 480 nanómetros para identificar las células ganglionares GFP positivas.

Esta imagen muestra una célula GFP positiva que se seleccionó para el registro de patch-clamp y se rellenó con un trazador fluorescente. La imagen confocal de las dendritas ipRGC obtenidas en la sublámina de encendido y apagado de la capa plexiforme interna permite la clasificación de estos tipos de células. Este resultado del bioanalizador muestra los ejemplos de bibliotecas que se han sometido a transcripción, amplificación y purificación inversas. Los carriles uno a tres muestran frotis de ADN ideales, mientras que el carril cuatro representa una muestra mal procesada.

El carril de control debe contener dos picos limpios con los tamaños de marcador de 35 pb y 10380 pb. Aquí hay un rastro detallado de una biblioteca preparada con éxito con alta intensidad de alrededor de 2 kb. Este rastro también demuestra una preparación exitosa, pero con el frotis centrado alrededor de 500 pb.

Esta imagen muestra la salida del bioanalizador después del etiquetado, amplificación y purificación de las muestras. Aquí se puede ver el rastro detallado de una muestra etiquetada con éxito, correspondiente a la muestra del carril uno. El etiquetado incompleto dará como resultado un rastro como el que se ve aquí, lo que justifica el reetiquetado con una nueva dilución.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el ARN de los tipos de células marcadas con fluorescencia en la retina intacta. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el ARN es muy sensible a la degradación y que tener células retinianas sanas es la clave. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la qPCR, la hibridación NC2 o la inmunohistoquímica, para responder a preguntas adicionales, como si los genes identificados son específicos de un subtipo celular determinado. Esta técnica ha allanado el camino para los investigadores en el campo de la neurociencia, que intentan comprender la heterogeneidad de las neuronas en varias regiones del cerebro. La comprensión de esta heterogeneidad permitirá futuros estudios de la función celular y la conectividad en poblaciones identificadas molecularmente.