Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

El objetivo de este abordaje quirúrgico es aplicar directamente tratamientos a nivel del cuerpo de la célula neuronal, y evaluar la regeneración axonal tras una intervención terapéutica, sin tener que realizar una lesión más dañina dentro del sistema nervioso central. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración de axones, como por ejemplo, ¿pueden los axones tratados terapéuticamente regenerarse en la médula espinal y posiblemente alcanzar los objetivos del tronco encefálico? La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden examinar la regeneración de los axones del SNC sin tener que lesionar directamente la médula espinal.

Esto reduce las complicaciones postquirúrgicas y mejora el bienestar animal. Comience por anestesiar adecuadamente al animal. Confirmación de un plano quirúrgico de anestesia por la ausencia de reacción a un pinzamiento del dedo del pie.

A continuación, pesa al animal y registra el peso preoperatorio. Para una inyección quirúrgica de DRG, afeita el pelaje del cuello desde entre las orejas hasta justo debajo de los escápulos. Desinfecte la zona afeitada con un producto antiséptico.

Inyectar dos mililitros de suero fisiológico por vía subcutánea en el flanco del animal, junto con una dosis adecuada de analgésico y antibiótico. Aplique ungüento ocular en ambos ojos para evitar que la córnea se seque durante el procedimiento. Coloque al animal en un marco estereotáxico espinal y coloque una almohadilla térmica a 37 grados centígrados debajo del animal.

Comience la cirugía ubicando las apófisis espinosas C2 y T2 prominentes sobre la piel. A continuación, utiliza un bisturí número 10 para hacer una incisión en la piel entre las apófisis espinosas C2 y T2. Una vez que se abre la piel, debe verse una línea media de tejido fibroso blanco en la primera capa de músculo, que tiene una textura gelatinosa.

Haz una incisión de tamaño similar en la primera capa de músculo a lo largo de la línea media blanca. No vaya más allá de la primera apófisis espinosa T2 prominente, ya que hay un vaso sanguíneo importante ubicado cerca de allí. Retraiga la primera capa de músculo usando dos retractores, uno colocado rostralmente y otro caudalmente.

La segunda capa de músculo con una apariencia estriada ahora debería ser visible. Localiza la línea media de la segunda capa de músculo, donde se pueden observar dos músculos longitudinales, conectados por un tejido delgado y membranoso. A continuación, utiliza unas microtijeras para diseccionar el tejido membranoso y separar los dos músculos longitudinales.

Ajuste los retractores para exponer la tercera capa de músculo delgado que cubre la columna vertebral. Las apófisis espinosas se pueden sentir tocando ligeramente con un par de pinzas sobre la tercera capa de músculo. Use microtijeras para hacer una pequeña incisión en la tercera capa de músculo y raspe suavemente el músculo del hueso, usando una cureta o bisturí de manera lateral, para exponer claramente las vértebras.

Para exponer los DRG C5 a C8 izquierdos, utilice un par de tijeras de hueso fino para realizar la hemilaminectomía izquierda en las vértebras C4 a T1, extirpando cuidadosamente parte de la lámina y el pedículo. Una vez que se haya expuesto una cantidad suficiente de DRG para la inyección, prepare la jeringa colocando la jeringa de microlitros llena de virus equipada con una aguja roma de calibre 33 hecha a medida en el soporte de la jeringa estereotáxica. A continuación, utilice una aguja biselada de calibre 30 para hacer una pequeña abertura superficial en cada uno de los DRG específicos para ayudar a insertar la aguja de inyección.

Ajuste suavemente las coordenadas estereotáxicas para insertar la aguja de calibre 33 en el centro del DRG. Idealmente, la aguja debe colocarse en el centro del DRG para garantizar una difusión uniforme de la solución inyectora en todo el DRG. Una vez insertada la aguja, utilice la bomba de jeringa de infusión para inyectar un microlitro del virus en cada GRD.

Durante la inyección, el DRG cambiará lentamente de color si la solución del virus contiene un tinte coloreado. No inserte demasiado la aguja, ya que esto puede hacer que el líquido se escape del lado ventral del DRG. En caso de fuga durante la inyección, ajuste la posición de la aguja inmediatamente.

Tres minutos después del final de la inyección, retire la aguja de inyección. Para realizar una lesión concurrente por aplastamiento de raíz dorsal C5 a C8, triture cada raíz tres veces durante 10 segundos, usando un par de pinzas de punta fina. Se opone completamente a los extremos de las pinzas.

Debe aparecer una línea blanca en el tejido en el sitio de trituración. Después de las cirugías, asegúrese de que no haya sangrado ni queden pequeños trozos de fragmentos óseos en el sitio de la incisión antes de cerrar. Si lo prefiere, coloque un pequeño trozo de esponja quirúrgica absorbible encima de la médula espinal expuesta y el DRG.

Permita que la tercera capa del músculo se retraiga naturalmente hacia la columna vertebral, sin suturar. Sutura sin apretar los dos músculos longitudinales de la segunda capa con material de sutura 6-0 reabsorbible. Sutura la primera capa del músculo con material de sutura 6-0 absorbible.

Sutura la piel con material de sutura 5-0 absorbible. Si se produjo una hemorragia abundante durante la cirugía, inyecte por vía subcutánea uno o dos mililitros de solución salina para reponer la pérdida de líquido del animal, según lo permitido por las regulaciones locales. Proporcionar gel hidratante comestible y permitir que el animal se recupere completamente de la anestesia.

Monitoree frecuentemente al animal durante al menos una hora antes de regresar al área de espera. Las siguientes imágenes muestran la recuperación de los animales postquirúrgicos al primer día, al séptimo día, después de la retirada de las suturas cutáneas y al día 14. Una semana antes de la recolección de tejidos, anestesiar adecuadamente al animal como antes, y luego estabilizar la pata delantera izquierda pegando la extremidad a la mesa.

Antes de la inyección de CTB, use una aguja biselada de calibre 30 para hacer una pequeña abertura superficial en la piel para ayudar con la inserción de la aguja de inyección. A continuación, utilice una jeringa de microlitros equipada con una aguja corta de calibre 33 hecha a medida, para inyectar lentamente un microlitro de 1% de CTB por vía subcutánea en el centro de la almohadilla glabra del pie y cuatro dedos. Permita que el animal se recupere completamente de la anestesia, antes de regresar al área de espera.

Esta imagen muestra el resultado de la inyección de DRG sin lesión por aplastamiento de la raíz dorsal. Los cuerpos celulares positivos para GFP y los axones de la médula espinal son claramente visibles cuatro semanas después de la inyección de AAV5GFP. Esta imagen de mayor aumento muestra los axones en la columna dorsal y el cuerno dorsal.

Los cuerpos celulares marcados con GFP en el DRG se ven aquí. Esta imagen muestra los terminales axónicos positivos de CTB en el núcleo de cuneato una semana después de la inyección de CTB. Las siguientes imágenes muestran los resultados de una lesión completa por aplastamiento de la raíz dorsal.

Como se ve aquí, los axones sensoriales axotomizados marcados con GFP pueden regenerarse hasta la zona de entrada de la raíz dorsal, pero no en la médula espinal después de una lesión. Esta es una imagen del núcleo de Cuneate en el mismo animal. Los terminales axónicos positivos para CTB están ausentes después de una lesión completa por aplastamiento de la raíz dorsal.

La presencia de axones marcados en la médula espinal después de una lesión representa una lesión incompleta o una regeneración. La presencia de terminales CTB positivos en el núcleo de cuneato sugiere una lesión incompleta, mientras que su ausencia sugiere una lesión completa y una regeneración potencialmente parcial en la médula espinal. Mientras se asiste a este procedimiento, es importante extirpar la cantidad justa de huesos de vértebras para exponer el DRG y la raíz dorsal, sin inducir ningún daño no deseado, especialmente en la médula espinal.

De lo contrario, esto puede resultar en complicaciones postquirúrgicas inesperadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una inyección de DRG. Puede incorporar otras técnicas como la lesión de la columna central, la electrofisiología, las pruebas de comportamiento y el análisis anatómico para examinar las regeneraciones de los axones.