Name: La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende la ablación quirúrgica de ojos en planarias para estudiar regeneración ocular y biología de células madre. Esta técnica permite eliminar tejidos con mínima perturbación del entorno neural.

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Los autores desean agradecer a Michelle Deochand para perfeccionar esta técnica de ablación ocular, Taylor Birkholz para obtener ayuda con el ensayo funcional, Michael Levin para el anticuerpo anti-arrestina y Junji Morokuma para obtener información sobre las placas Peltier. Este trabajo fue apoyado por una beca SFSA de la Western Michigan University a WSB.

1. Cultura Animal y Manejo NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, una especie planarian diploides con un genoma secuenciado 16, 17 que se utiliza comúnmente para la investigación de regeneración. Sin embargo, el ensayo es el mismo éxito con otras especies, tales como Girardia tigrina y dorotocephala Girardia (que están disponibles en el comercio). <ol><li> Mantener gusanos en &quot;agua gusano&quot; hecho a partir de sales / L de mar 0,5 g en ultrapura (o filtrada desionizada) agua. Utilice recipientes de polipropileno o de vidrio estériles para contener el agua gusano. Ver <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Archivo 1</a> para más detalles sobre la preparación de agua gusano. NOTA: Nunca use jabón para limpiar los contenedores (u otros suministros) como jabón es tóxico para los gusanos; en lugar limpie con etanol al 70% y dejar secar al aire. &lt;ol&gt; <li> Use guantes cuando se trabaja con planaria para protegerlos de la contaminación. NOTA: Los gusanos son muy sensibles a las toxinas y productos químicos ambientales, incluyendo el jabón, lejía, champú, acondicionador y crema para las manos. </li></ol></li><li> colonias Casa en contenedores de alimentos de polipropileno, con la tapa dejaron parcialmente abierta para el intercambio de aire a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Tiendas gusanos experimentales, ya sea en placas de Petri (20 gusanos por placa de 100 mm) o placas no tratadas de cultivo de tejidos (1 gusano por pocillo, para placas de 12 pocillos). Para reducir el estrés, mantener las dos colonias y experimentos en la oscuridad. NOTA: Las colonias deben tener no más de 500-1.000 gusanos por litro de agua gusano. Para los experimentos, salir de tapas en pleno funcionamiento, ya que el flujo de aire se diseña en estos platos. </li><li> Alimentar a los gusanos no experimentales una vez a la semana con puré de carne orgánica o de hígado de pollo al dejar caer el puré de una pipeta de transferencia, colocando gotas de alimentos en todo el recipiente. Permitir gusanos 2 h a consumir alimentos en eloscuro antes de la limpieza de recipiente (véase el paso 1.4). Antes de su uso, el puré de almacenar a -20 ° C para corto plazo (semanas) o -80 ° C para el largo plazo (meses); no volver a congelar el puré para su reutilización (como las bacterias pueden florecer y dañar a los gusanos). NOTA: Hígado no debe contener hormonas o antibióticos y preferiblemente no ser previamente congelado. Centrifugar puré antes de la congelación (o antes de la alimentación) para eliminar el aire y evitar que los alimentos flotante. La comida debe hundirse hasta el fondo del recipiente. 1 ml de puré es suficiente para 500-1.000 gusanos. </li><li> Cambio de agua una vez por semana con agua fresca para el gusano de ambas colonias y experimentos. contenedores de colonias también se deben limpiar con una toalla de papel sin blanquear (para eliminar los residuos de moco que los desechos TRAP) una vez a la semana para pasar hambre gusanos, o dos veces a la semana para los gusanos de alimentación (2 h después de la alimentación y de nuevo 2 días más tarde). Con el fin de conservar la biopelícula, no limpie más del 80% del depósito. </li><li> Mueva gusanos entre contenedores (o setu cirugíap) utilizando una pipeta de transferencia. Para gusanos libres adheridas a superficies del recipiente, chorro de agua sobre / detrás del gusano para liberarla de la superficie. A continuación, aspirar el gusano en la pipeta, mientras trata de mantener el gusano dentro de la porción inferior pulgadas (más delgada) de la pipeta. <ol><li> pipetas de retrocarga con una pequeña cantidad de agua gusano antes de succión hacia arriba. </li><li> Tratar de mover el agua alrededor del gusano, en lugar del propio gusano, para ayudar a evitar que se desgarre gusanos de cuerpo blando tocándolos con la pipeta. </li><li> Mantenga platos experimentales cubiertos, salvo que la transferencia de gusanos o sustitución de agua. </li></ol></li></ol> 2. Preparación <ol><li> Dejar de alimentar a los gusanos al menos una semana antes de los experimentos. <ol><li> Seleccionar gusanos que no han sido criados durante ≥1 semana y al menos 5-7 mm de longitud. La transferencia de los gusanos a una placa de Petri 2/3 lleno de agua gusano, y confirmar la longitud del gusano deslizando una regla debajo del plato. medir wORMS mientras completamente extendidos y en movimiento. NOTA: Mientras más pequeño (5-7 mm) gusanos funcionan mejor cuando se realiza inmunofluorescencia posterior y en los análisis de hibridación in situ, gusanos más grandes (8-10 mm) son más fáciles de trabajar con - especialmente cuando aprender a realizar la ablación. </li><li> Asegúrese de que los gusanos son entera, sin daños, y no recientemente regeneración. NOTA: La regeneración de los gusanos tendrán mucho más ligero pigmento (o no) en la cabeza y / o región de la cola en comparación con gusanos normales. </li><li> Si se realiza la ARNi o tratamientos farmacológicos en gusanos, hacerlo en este momento. Si gusanos fueron alimentados como parte del tratamiento (como por RNAi), esperar al menos 7 días después de la última alimentación antes de continuar con el paso 2.2. </li></ol></li><li> Limpiar la base del microscopio espacio de trabajo y de disección con 70% de etanol y permita que se seque por completo. Coloque el plato de gusanos seleccionados a la izquierda de la mira telescópica. A la derecha del alcance, colocar un par de # 5 fórceps, un 31 G 5 aguja de insulina / 16 pulgadas con una 1jeringa ml, y una pipeta de transferencia limpia. <ol><li> Asegúrese de que los instrumentos se mantienen de tocar el banco (que podría introducir contaminantes). Utilizar un elemento rígido (como por ejemplo un resto del palillo) para mantener el fórceps, agujas, y la pipeta limpia. Alternativamente, el lugar instrumentos en la parte superior de un color marrón (no blanqueada) toalla de papel limpia. NOTA: Estos y posteriores instrucciones están escritas, ya que pertenecen a los individuos diestros. individuos zurdos deben invertir las direcciones derecha / izquierda. </li></ol></li><li> Junto a la zona de trabajo, colocar una caja de toallitas paño libre de pelusa, una fuente de agua fresca del gusano, y algunas pipetas de transferencia adicionales (protegido de la mesa de trabajo). Abertura agua gusano en una botella de lavado de plástico para facilitar la dispensación. También colocar una placa de marcado de 12 pocillos (o 100 mm placa de Petri) a la derecha del alcance de recogida de animales ablación. </li><li> Si se utiliza una placa Peltier hechos a medida para inmovilizar gusanos, coloque la placa Peltier en la depresión en tél base del microscopio de disección y ajustar la salida de la fuente de alimentación de CC hasta que la superficie de trabajo de la placa Peltier es lo suficientemente frío (normalmente ~ 5 V) .Alternatively, hacer una placa fría llenando un plato de 100 mm Petri ½ completo con agua y congelar durante al menos 24 h. Descartar la tapa y coloque la parte inferior de la placa de 100 mm en la base del microscopio de disección, a continuación, colocar la tapa de una placa de Petri de 60 mm al revés directamente en la superficie del hielo (Figura 1A). <ol><li> Después de que el agua ha congelado en el plato de 100 mm, un &quot;volcán&quot; de hielo puede aparecer en el centro de la placa. Si esto sucede, utilice una hoja de afeitar para raspar el hielo plana, para eliminar las irregularidades de la superficie. NOTA: Durante las cirugías el hielo se derrite, haciendo ablaciones mucho más difícil. Preparar varios platos de hielo con antelación, y reemplazar los congelados para la fusión queridos durante el ensayo tan pronto como la tapa de la placa de 60 mm comienza flotante. </li></ol></li><li> Prepara lasuperficie de la cirugía. Cortar una pieza de 5 cm x 10 cm de película de parafina de plástico (4 cm 2 si se utiliza la placa de Petri placa fría) y colocarlo en el centro del dispositivo de inmovilización. Doble un paño libre de pelusa limpie en un cuadrado de aproximadamente 2 cm 2 y colocarlo en la parte superior de la película. Cortar una pieza de filtro de papel blanco 1,5-2 cm 2 y colocarlo en la parte superior de la toallita. Véase la Figura 1B-1E. <ol><li> Mantenga la toallita plegada en su lugar con un dedo enguantado, y el uso de agua para humedecer ligeramente gusano de la toallita para asegurarse de que permanece plegada. Utilice el lado de una pipeta de transferencia para rodar la toallita plana. NOTA: La temperatura fría ayuda a mantener los gusanos se mueva. Trabajar &quot;en seco&quot; también ayuda en la inmovilización. El tejido limpie actos para absorber agua a través del papel de filtro, manteniendo el gusano húmedo durante la cirugía sin permitir que los gusanos se sequen por completo (que es letal). </li></ol></li></ol> 3. La ablación quirúrgica <ol><li> Utilice una pipeta de transferencia para colocar enlado e gusano dorsal arriba sobre el papel de filtro. Encienda la fuente de luz y dirigir los cuellos de cisne para que la luz se centra en el gusano. Ajustar el enfoque disección alcance y la ampliación de manera que los ojos son claramente visibles (todo el gusano no tiene que estar a la vista); 5 aumentos es un buen punto de partida. Oriente el gusano mediante la rotación de la película de parafina de manera que la cabeza está orientado hacia el investigador (hacia la parte frontal del microscopio), en ángulo de 30-40 grados a la derecha. <ol><li> Evitar el uso de una luz brillante para evitar el exceso de movimiento de gusano. Las planarias muestran fototaxis negativos y tratarán de evadir la luz brillante. </li><li> Si el gusano se coloca lado ventral hacia arriba (con la apertura visible faríngea), utilice el lado opaco del fórceps para volver a colocar suavemente el lado gusano dorsal hacia arriba (con los ojos visibles). Evitar acercarse al animal con la punta afilada de la pinza para minimizar la posibilidad de romper a través de los tejidos blandos cuando el reposicionamiento del animal. </li><li&gt; Ajuste el enfoque del microscopio de modo que los ojos son claramente en el centro. También aseguran que tanto los ojos y los tejidos que rodean la cabeza están a la vista. </li></ol></li><li> Mantenga una aguja / jeringa fresca en la mano derecha como si se tratara de una pluma (entre el pulgar y el dedo índice). Brace el pulgar izquierdo contra la placa Peltier (o placa de Petri placa fría), y utilizar el pulgar izquierdo como punto de apoyo sobre la que descansará la parte inferior de la jeringa (Figura 2A). Mire a través del microscopio, y asegúrese de que el bisel de la aguja es visible. NOTA: Las agujas son muy afiladas. Tenga cuidado al manipularlos. El uso de guantes de látex o nitrilo puede ofrecer alguna protección. <ol><li> Utilice el pulgar izquierdo para ayudar a mantener la aguja / jeringa constante durante todo el procedimiento y evitar dar la mano. </li><li> Hacer un ángulo de aproximadamente 40 ° con el pulgar izquierdo y el dedo índice izquierdo (con el dedo índice en la superficie de la cirugía) para ayudar a mantener la stabile superficie de la cirugía. </li></ol></li><li> Conel bisel de la aguja orientada hacia arriba (como una cuchara), la posición de la aguja en ángulo recto con el ojo (Figura 2B). Utilice la punta de la aguja para penetrar suavemente la capa delgada de tejido que cubre la copa óptica (blanco, región sin pigmentar) del ojo, recogiendo de derecha a izquierda. Muy retire con cuidado el tejido pigmentado situado dentro de la copa óptica, teniendo cuidado de no perforar el fondo o destruir los bordes de la copa óptica. <ol><li> Si el gusano ha estado en el papel de filtro para&gt; 1-2 min en cualquier punto durante el procedimiento, añadir una gota de agua gusano para rehidratar el gusano. NOTA: La deshidratación aumenta la susceptibilidad del gusano de lesiones que rasga. </li></ol></li><li> Repita el paso 3.3 hasta que todos los tejidos pigmentados de negro (células de pigmento), así como todos los tejidos blancos de la copa óptica (dendritas de las células fotorreceptoras), se eliminan. Eliminar tejidos extirpados pegados al extremo de la aguja limpiando cuidadosamente con un pañuelo de papel toallita. Si abla doble ojose desea ción, la ablación del segundo ojo en este punto. NOTA: Para evitar lesiones, agujas puede ser limpiado sujetando la aguja con un pañuelo de papel limpio toallita celebrada con el pulgar y el índice, a continuación, utilizando la otra mano para tirar de la aguja a través de la toallita de distancia del pulgar y el índice. Alternativamente, la aguja se puede limpiar en la superficie de un tejido toallita húmeda y se examina para la limpieza. </li><li> Cuando haya terminado, utilizar una pipeta de transferencia para mover el gusano a un plato de marcado que contiene agua gusano fresco. Si el análisis de datos de grupo, colocar hasta 20 gusanos en un solo 100 mm placa de Petri. Si el seguimiento de la regeneración en los mismos individuos con el tiempo, colocar 1 gusano en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Una vez que todos los gusanos se transfieren, enjuague gusanos mediante la eliminación de toda el agua gusano de los platos / pozos y la sustitución con más agua dulce gusano. <ol><li> Para eliminar gusanos del filtro, recargues la pipeta con una pequeña cantidad de agua sin fin y liberar el agua sobre el gusano. Esto debe levantar tél gusano fuera el papel de filtro, para ser aspirado inmediatamente en la pipeta para la transferencia. </li></ol></li><li> Incubar experimentos a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) protegidos de la luz y siga el proceso regenerativo. NOTA: Los gusanos pueden ser almacenados en una incubadora de temperatura controlada para mantener una temperatura constante, pero esto no es estrictamente necesario. La mayoría de las temperaturas ambiente variando únicamente por la 5 ° C, lo cual no afectará la capacidad del gusano de regenerarse. </li><li> Si se desea, fijar gusanos para inmunohistoquímica (véase las figuras 3-4) y / o en los análisis de hibridación in situ de la expresión génica. Existen diferentes métodos de fijación para inmunohistoquímica planaria 18, 19, 20 y la hibridación in situ 21, 22, 23 protocolos. </li><li> Cuando los experimentos se llegó a la conclusión, sacrifice viven gusanos mediante la eliminación de agua gusano de la cápsula y su sustitución con 70% de etanol. Incubar gusanos durante 3-5 min, la comprobación de los gusanos para lisar y gire grisáceo. </li><li> Coloque gusanos no tratados en la corriente de residuos normal una vez sacrificado. Evitar la introducción de gusanos vivos en el medio ambiente, en particular las especies no autóctonas. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta técnica de ablación ojo mejora sobre los métodos actuales (tales como perforadora) por exclusión de los tejidos del cerebro y la restricción de escisión principalmente a los tejidos del ojo. Con la práctica, esta técnica puede ser realizada por la mayoría de los individuos, de los técnicos con experiencia en microcirugía a los estudiantes universitarios sin experiencia, sino de conciencia. Se recomienda que esta técnica puede practicar muchas veces antes de usar ablaciones en experimentos, incluyendo (cuando sea po...

Las planarias son una poderosa organismo modelo para el estudio de madre adultas regeneración mediada por células. Estos gusanos planos de agua dulce no parasitarias poseen la capacidad de regenerar cualquier y todos los tejidos perdidos, incluyendo su sistema nervioso central y el cerebro 1. Estudió tan atrás como la década de 1700 2, los avances tecnológicos en el campo planaria durante los últimos 10-15 años (como un genoma secuenciado, hibridación in situ, inmunohistoquímica, RNA de interferencia (RNAi), y transcriptómica) han actualizado este organismo modelo histórico . En concreto, las planarias recientemente han ganado popularidad como un modelo emergente para la investigación del ojo 3. Planarias tienen ojos prototípicos con sólo dos tipos de tejido, las neuronas fotorreceptoras y las células de pigmento; esto ha permitido la caracterización de la población de células madre del ojo y demostrado que muchos de los mismos genes que regulan vertebrado ojo desarrollo se conservan en planarias 4, 5. Las copas óptica están situados dorsalmente y compuestas de los blancos, las dendritas no pigmentados de las neuronas fotorreceptoras y las células de pigmento negro semi-lunares, y los ojos inervan el cerebro a través de un quiasma óptico. Además de ser un modelo para elucidar los procesos regenerativos 6, el ojo planaria es muy adecuado para el estudio de la evolución de los mecanismos visuales 7, las respuestas de comportamiento a la luz (planarias muestran fototaxis negativo) 8, y las bases neurológicas del comportamiento 9. La regeneración de los ojos en planarias se ha estudiado en gran parte en dos contextos principales: como parte de regeneración de la cabeza después de la decapitación 4, 10, y después de la escisión de sólo los tejidos del ojo 11, 12 </sup&gt;. La mayoría de los estudios sobre la regeneración de las planarias ojos han utilizado el método de la decapitación, ya que es simple y directo. El método de escisión ojo planaria más común hasta la fecha ha sido a través de perforadora con un fino tubo capilar de vidrio 13, 14, aunque algunos estudios también han realizado amputaciones justo detrás de los ojos (decapitación parcial) 15. Sin embargo, todos estos métodos implican la pérdida de muchos tejidos que no sean sólo el ojo (tales como el cerebro, los intestinos y nefridios), complicando potencialmente la interpretación de los resultados. El protocolo de ablación ojo que aquí se presenta restringe la escisión de los tejidos del ojo (específicamente con exclusión de cerebro), resultando en datos que son más específicos para el ojo. Además, a diferencia de los gusanos decapitados que tienen 7-14 días para iniciar la alimentación, gusanos oculares ablación se alimentarán dentro de 24 h de ablación 12, lo que permite experimentos de RNAi (donde RNAi se entrega a través de los alimentos) para ser performed simultáneamente. A pesar de que la ablación del ojo es técnicamente más difícil de realizar con éxito de la decapitación, los estudios actuales que implican la extirpación del ojo no han incluido instrucciones detalladas sobre sus procedimientos. El objetivo de este artículo de vídeo es permitir a los investigadores para eliminar sistemáticamente la copa óptica planaria sin molestar a los tejidos cerebrales subyacentes y eliminar la menor cantidad de otros tejidos como sea posible. Este método puede ser utilizado tanto para la ablación simple y doble ojo y es aplicable a una amplia gama de investigaciones. Como la mayoría de los ensayos de regeneración, la ablación del ojo es muy adecuado para la combinación con las dos pantallas farmacológicos y genéticos (RNAi), así como los estudios de comportamiento. Aquí se describen los métodos para la manipulación de los gusanos, el mantenimiento de una colonia planaria, y la técnica de ablación ojo mismo.

<table><tbody><tr><td>Sales marinas oceánicas instantáneas</td><td>Spectrum Brands&nbsp;</td><td>SS15-10</td> <td>"Caja de 10 galones"&nbsp; (peso neto 3 libras)</td></tr><tr><td>Toallita tisúa sin pelusa Kimwipes EX-L</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&nbsp;</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman #2</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Círculos, 125 mm de diámetro, blanco</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina Easy Touch (con aguja)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&nbsp; U-100 Jeringa de 1 cc, aguja de 31 G 5/16 pulgadas Placa de</td></tr><tr><td>Petri de 100 mm</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&nbsp; pinzas&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, punta recta, 11 cm</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia&nbsp;</td><td>Samco Scientific&nbsp;</td><td>225</td><td>Graduado, bulbo grande, 7,5 mL, no estéril</td></tr><tr><td>Película de parafina Parafilm M</td><td>Marca&nbsp;</td><td>701606</td><td>&nbsp; Rollo de 4 pulgadas x 125 pies</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos sin tratar de 12 pocillos</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Sin tratar, fondo plano, estéril, marca Falcon</td></tr><tr><td>Recipientes de plástico para alimentos (para colonias)&nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Rectángulo grande</td><td>de 2.25 cuartos (2.12 L), 10" x 6 -3/4" x 3 -3/16"&nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (Girardia tigrina)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Vendida como Planaria "marrón"; la mayoría de las veces son G. tigrina (también conocida como Dugesia tigrina), pero a veces son G. dorotocephala (también conocida como Dugesia dorotocephala); cualquiera de las dos funcionará.</td></tr><tr><td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>S. mediterranea no están disponibles comercialmente. En este momento, los animales solo se pueden obtener de laboratorios que los usan y tienen animales adicionales.</td></tr><tr><td>Toallas de papel marrones&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>Toalla de papel plegable de 1 capa de 9-3/16 x 9-3/8", SIN BLANQUEAR</td></tr><tr><td>Botella de lavado (para agua de gusano), opcional</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Botellas de lavado, polietileno de baja densidad, boca ancha, 500 mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo antisinapsina, opcional</td><td>Estudios del desarrollo Banco de Hibridoma</td><td>3C11</td><td>Sobrenadante</td></tr><tr><td>Anticuerpo antiarrestina, opcional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>No está disponible comercialmente. Amable regalo de Michael Levin, Universidad de Tufts</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy garrafa con grifo (para almacenar agua de gusano), opcional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&nbsp; polipropileno, el perfil bajo facilita el llenado de contenedores de colonias de plástico&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa Peltier personalizada,</td><td>máquina Williams opcional, Foxboro, MA&nbsp;</td><td>n/a</td><td>Detalles del diseño cortesía de Junji Morokuma, Tufts University:&nbsp; La placa Peltier está construida con una bomba de calor termoeléctrica estándar (por ejemplo, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&nbsp; La bomba de calor cuadrada se cubre con una fina superficie espejada y, a continuación, se coloca dentro de un orificio cuadrado de 30 mm2 en forma de plexiglás circular (~50 mm de diámetro). Esta forma es de un grosor similar al de la bomba de calor y encaja al ras en un pozo mecanizado en el centro de un disipador de calor redondo (~115 mm de diámetro). La forma/bomba de calor es&nbsp; "Anclado" al fregadero con compuesto de disipador de calor a base de silicona. Los cables se enroscan a través de orificios perforados tanto en la forma como en el disipador de calor. La mitad inferior del disipador de calor está formada por un "pie" que encaja en la abertura de la placa base del microscopio.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de CC (para placa Peltier), opcional</td><td>B & K Precision</td><td>1665</td><td>Fuente de alimentación de CC de bajo voltaje regulada, 1-18 V (CC), 1-10 amperios.</td></tr><tr><td>Otros suministros</td><td></td><td></td><td></td>comunes</tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, cuchilla de afeitar&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visor de disección con iluminación</td><td></td><td></td><td></td>de cuello de cisne</tr><tr><td>Soportes para palillos, opcional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

En el estudio de células madre adultas y mecanismos regenerativos, gusanos planos planarian son un elemento básico en el sistema de modelo in vivo. Esto se debe en gran parte a su abundante población de células madre pluripotentes y capacidad de regenerar todos los tipos de células y tejidos después de las lesiones que serían catastróficas para la mayoría de los animales. Recientemente, las planarias han ganado popularidad como un modelo para la regeneración de los ojos. Su capacidad para regenerar todo el ojo (compuesto de dos tipos de tejidos: células de pigmento y fotorreceptores) permite la disección de los mecanismos que regulan la regeneración del sistema visual. ablación Eye tiene varias ventajas sobre otras técnicas (tales como la decapitación o perforadora) para examinar vías y mecanismos de ojo específico, el más importante de los cuales es que la regeneración se limita en gran parte a los tejidos del ojo solo. El propósito de este artículo de vídeo es demostrar cómo eliminar de forma fiable la copa óptica planaria sin perturbar el cerebro o en los tejidos circundantes.También se describe la manipulación de los gusanos y de mantenimiento de una colonia establecida. Esta técnica utiliza un 31 G, aguja de insulina 5/16 pulgadas para sacar quirúrgicamente a cabo la copa óptica de planarias inmovilizados en un plato frío. Este método abarca tanto la ablación simple y doble ojo, con los ojos en regeneración dentro de 1-2 semanas, lo que permite una amplia gama de aplicaciones. En particular, esta técnica de ablación se puede combinar fácilmente con pantallas farmacológicos y genéticos (ARN de interferencia) para una mejor comprensión de los mecanismos regenerativos y su evolución, las células madre del ojo y su mantenimiento, y las respuestas de comportamiento phototaxic y su base neurológica.

Para el primero después de la cirugía 1-2 h, los animales pueden muestran una disminución de movimiento en comparación con gusanos intactos (sin embargo, todavía se moverán). Si se desea, los gusanos se comerán dentro de las 24 h de la cirugía (por ejemplo, para la alimentación de RNAi). Cuando después de la regeneración ojo en los mismos individuos en el tiempo, asegúrese de tomar una fotografía de cada gusano tanto antes de la cirugía (intacto) y en 1 h post ablación (hpa). A los 4 día...

Este protocolo se muestra cómo extirpar consistentemente ojos planarias (tazas óptica) sin molestar a los tejidos circundantes. Usando una aguja de insulina y la jeringa, ya sea uno o ambos ojos pueden ser ablacionada para facilitar las investigaciones sobre los mecanismos que regulan la regeneración ojo, la evolución de la regeneración visual, y la base neural de la conducta inducida por la luz.

La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo eliminar de forma confiable la copa óptica de la planaria sin alterar el cerebro ni los tejidos circundantes, de modo que la técnica pueda ser implementada por investigadores y estudiantes de todos los niveles educativos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración, como determinar los mecanismos que regulan el mantenimiento y la diferenciación in vivo de las células madre oculares endógenas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores eliminar únicamente los tejidos oculares con una perturbación mínima de otros tejidos. Por lo general, se requiere práctica antes de que las personas nuevas en este método puedan extraer de forma confiable la cantidad correcta de tejido, ablacionando todo el ojo mientras evitan la ablación de los tejidos circundantes. Para comenzar, seleccione gusanos que no hayan sido alimentados durante al menos una semana y que tengan al menos cinco a siete milímetros de largo. Transfiera de 15 a 30 gusanos a una placa de Petri de 100 milímetros llena hasta dos tercios de agua para gusanos e inmediatamente reemplace la tapa.Observe los gusanos en busca de tejidos faltantes o despigmentados, como cabezas o colas blancas, para asegurarse de que estén intactos y no estén en proceso reciente de regeneración. Primero, limpie la superficie de trabajo y la base del microscopio de disección con una solución de etanol al 70 %, y deje que se seque completamente. Coloque el recipiente con los gusanos seleccionados en el lado izquierdo del microscopio.Luego, en el lado derecho del microscopio, coloque un par de pinzas número cinco, una aguja de insulina de calibre 31 y 5/16 de pulgada con una jeringa de un mililitro, una pipeta de transferencia limpia y una placa de 12 pocillos etiquetada para recolectar los gusanos ablacionados. Coloque una caja de toallitas sin pelusa, una botella de lavado de plástico llena de agua fresca para gusanos y pipetas de transferencia adicionales de manera que estén fácilmente accesibles durante la cirugía. Coloque una placa Peltier en el centro de la base del microscopio estereoscópico y ajuste la salida de la fuente de alimentación de corriente continua para que la superficie de la placa Peltier esté lo suficientemente fría como para inmovilizar a los gusanos.Alternativamente, se puede utilizar una placa de Petri llena de hielo en lugar de una placa termoeléctrica. Para preparar la superficie quirúrgica, primero corte un trozo de película de parafina plástica de cinco centímetros por diez centímetros y colóquelo sobre el centro de la placa termoeléctrica. A continuación, doble una toallita sin pelusa en un cuadrado de aproximadamente dos centímetros y colóquela encima de la película.Luego, mantenga la toallita doblada en su lugar, humedézcala con agua de gusanos y aplane la toallita con una pipeta de transferencia. Finalmente, corte un trozo de papel de filtro blanco de entre 1,5 y dos centímetros cuadrados, y colóquelo encima de la toallita. Para comenzar la cirugía, coloque un gusano con el lado dorsal hacia arriba sobre el papel de filtro, utilizando la pipeta de transferencia.Encienda la luz y enfoque su haz sobre el gusano. Ajuste el enfoque y la ampliación del microscopio estereoscópico para que los ojos del gusano sean claramente visibles. Gire la película de parafina para ajustar la posición del gusano de modo que su cabeza apunte hacia el investigador y forme un ángulo de 30 a 40 grados hacia la derecha.Si el gusano está posicionado con el lado ventral hacia arriba y la abertura faríngea es visible, utilice el lado romo de la pinza para cambiar suavemente la posición del gusano, colocándolo con el lado dorsal hacia arriba y los ojos visibles. Ajuste nuevamente la configuración del microscopio para que los ojos estén claramente enfocados. Asegúrese también de que tanto los ojos como los tejidos circundantes de la cabeza sean visibles.Sostenga una jeringa limpia con la mano derecha entre el pulgar y el índice. Sujete la parte inferior de la jeringa con el pulgar izquierdo, apoyado contra la placa Peltier. Observe a través del microscopio para asegurarse de que la bisel de la aguja sea visible.Coloque el dedo índice izquierdo sobre la superficie quirúrgica de modo que forme un ángulo de 40 grados con el pulgar izquierdo para asegurar que la superficie permanezca estable durante el procedimiento. Coloque la aguja en un ángulo de 90 grados respecto al ojo, con el bisel de la aguja orientado hacia arriba. Con la punta de la aguja, penetre suavemente la capa delgada de tejido que recubre la copa óptica del ojo, visible como una región blanca e despigmentada.Con movimientos de derecha a izquierda, retire con mucha suavidad cualquier tejido pigmentado negro ubicado dentro de la copa óptica, así como todos los tejidos blancos. Si se realiza la ablación doble de ojos, ablate ahora el segundo ojo. Tras completar la cirugía, cargue la pipeta desde atrás con una pequeña cantidad de agua para gusanos y libere el agua sobre el gusano para levantarlo del papel filtro.Introduzca inmediatamente el gusano en la pipeta de transferencia. Transfiera el gusano a una placa de 12 pocillos etiquetada, llena hasta dos tercios con agua fresca para gusanos. Una vez que todos los gusanos hayan sido transferidos, lávelos reemplazando el agua de los pocillos con agua fresca para gusanos.Incube los gusanos protegidos de la luz en un incubador a 20 grados Celsius y supervise el proceso de regeneración. Para sacrificar los gusanos vivos, retire el agua de los gusanos de la placa y sustitúyala con etanol al 70%. Incube los gusanos durante tres a cinco minutos y observe si los gusanos lisian y se vuelven grises.Se presentan aquí fotografías de gusanos planarios sometidos a ablación doble del ojo y ablación simple del ojo, tomadas antes, cuatro días después y dos semanas después del procedimiento quirúrgico. Las imágenes muestran el progreso de la regeneración a lo largo del tiempo. La regeneración ocular en los gusanos ablatados también se confirmó mediante tinción inmunohistoquímica de arrestina y neuronas fotorreceptoras recién desarrolladas.La recuperación del sistema visual en planarias tras la ablación doble de los ojos también se estudió mediante un ensayo funcional basado en la respuesta fotofóbica de tipo silvestre a la luz. Veinticuatro horas después de la ablación, las planarias sin ojos no evitan la luz y atraviesan zonas iluminadas. La fotofobia se restablece a los siete días posteriores al procedimiento, lo que indica que el sistema visual regenerado es funcional.Una vez dominado, el procedimiento de ablación doble de los ojos de un gusano puede realizarse en aproximadamente tres minutos. Durante la ablación, es importante extirpar todos los tejidos pigmentados y no pigmentados del ojo, asegurándose de no dañar el tejido entre los ojos ni de desgarrar el tejido hacia la parte posterior del ojo. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunohistoquímica e interferencia de ARN para examinar el papel de genes específicos y su proceso regenerativo.Además, se pueden realizar ensayos conductuales para evaluar la función ocular tras el regrow. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extirpar los ojos de los planarios sin alterar los tejidos circundantes. No olvide que trabajar con agujas puede ser peligroso, y se deben tomar precauciones como usar guantes y sostener la aguja apuntando lejos de usted.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser...

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Un modelo atractivo para el estudio de la diferenciación de células madre en un animal vivo es el gusano planaria. La regeneración se estudia por medio de experimentos sencillos que la amputación se realiza fácilmente en un laboratorio básico y son susceptibles de (farmacológicos y...

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.

La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido

Fuente: Volpe, B. A., et al. Ensayo de ablación y regeneración láser basado en microscopio confocal en células interneuromast de pez cebra. J. Vis. Exp.{{TAG_ 31}} (2020) Este video demuestra el monitoreo de la recuperación de los interneuromastocitos en el pez cebra utilizando microscopía confocal, rastreando la muerte celular y la reparación a través de imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo.

Monitorización de la recuperación de células interneuromasto ablacionadas con láser en pez cebra mediante microscopía confocal

Debido a que muchos modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos en lugar de el embrión / larvas, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo regenerativa línea lateral que se puede aplicar a modelos de enfermedad de pez cebra adultos. El ensayo implicó resolución en el neuromast 1) y 2) los niveles de células cabello individual.

Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

El planarian Schmidtea mediterranea es un excelente modelo para estudiar las células madre y regeneración de los tejidos. Esta publicación describe un método para eliminar selectivamente un órgano, la faringe, por la observación de animales de la azida de sodio químicos. Este protocolo también describe métodos para el monitoreo de la regeneración de la faringe.

Química la amputación y la regeneración de la faringe en el Planarian Schmidtea mediterranea

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Aprende la ablación quirúrgica de ojos en planarias para estudiar regeneración ocular y biología de células madre. Esta técnica permite eliminar tejidos con mínima perturbación del entorno neural.

La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

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