La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

Este protocolo se muestra cómo extirpar consistentemente ojos planarias (tazas óptica) sin molestar a los tejidos circundantes. Usando una aguja de insulina y la jeringa, ya sea uno o ambos ojos pueden ser ablacionada para facilitar las investigaciones sobre los mecanismos que regulan la regeneración ojo, la evolución de la regeneración visual, y la base neural de la conducta inducida por la luz.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo extraer de forma fiable la copa óptica planaria sin perturbar el cerebro o los tejidos circundantes para que la técnica pueda ser implementada por investigadores y estudiantes de todos los niveles educativos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo regenerativo, como determinar los mecanismos que regulan el mantenimiento y la diferenciación de las células madre oculares endógenas in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores extirpar solo los tejidos oculares con una alteración mínima de otros tejidos.

Por lo general, se requiere práctica antes de que las personas nuevas en este método puedan extraer de manera confiable la cantidad correcta de tejido, ablacionando todo el ojo y evitando la ablación de los tejidos circundantes. Para comenzar, seleccione lombrices que no hayan sido alimentadas durante al menos una semana y que midan al menos de cinco a siete milímetros de largo. Transfiera de 15 a 30 lombrices a una placa de Petri de 100 milímetros, dos tercios llena de agua de gusanos, y reemplace inmediatamente la tapa.

Observe a los gusanos en busca de tejidos faltantes o sin pigmentar, como cabezas o colas blancas, para asegurarse de que no estén dañados y no se regeneren recientemente. Primero, limpie el espacio de trabajo y la base del microscopio de disección con una solución de etanol al 70% y deje que se seque por completo. Coloque el plato con los gusanos seleccionados en el lado izquierdo del microscopio.

Luego, en el lado derecho del microscopio, coloque un par de pinzas número cinco, una aguja de insulina de calibre 31 de 5/16 de pulgada con una jeringa de un mililitro, una pipeta de transferencia limpia y una placa de 12 pocillos etiquetada para recolectar gusanos ablacionados. Coloque una caja de toallitas desechables sin pelusa, una botella de plástico llena de agua fresca para lombrices y pipetas de transferencia adicionales para que puedan acceder fácilmente a ellas durante la cirugía. Coloque una placa Peltier en el centro de la base del microscopio de disección y ajuste la salida en la fuente de alimentación de CC para que la superficie de la placa Peltier esté lo suficientemente fría como para inmovilizar los gusanos.

Alternativamente, se puede usar una placa de Petri llena de hielo en lugar de una placa Peltier. Para preparar la superficie de la cirugía, primero corte un trozo de película plástica de parafina de cinco centímetros por diez centímetros y colóquelo sobre el centro de la placa Peltier. A continuación, dobla una toallita de papel sin pelusa en un cuadrado de aproximadamente dos centímetros y colócala encima de la película.

Luego, sostenga la toallita doblada en su lugar, humedézcala con agua de lombriz y enrolle la toallita con una pipeta de transferencia. Por último, corta un trozo de papel de filtro blanco de 1,5 a dos centímetros cuadrados y colócalo encima de la toallita. Para comenzar la cirugía, coloque un gusano con el lado dorsal hacia arriba sobre el papel de filtro, utilizando la pipeta de transferencia.

Enciende la luz y enfoca su haz en el gusano. Ajuste el enfoque y el aumento del microscopio de disección para que los ojos del gusano sean claramente visibles. Gire la película de parafina para ajustar la posición del gusano de modo que su cabeza apunte hacia el investigador y se incline de 30 a 40 grados hacia la derecha.

Si el gusano está colocado con el lado ventral hacia arriba y la abertura faríngea es visible, use el lado desafilado de las pinzas para cambiar suavemente la posición del gusano al lado dorsal hacia arriba con los ojos visibles. Vuelva a ajustar la configuración del microscopio para que los ojos estén claramente enfocados. También asegúrese de que tanto los ojos como los tejidos circundantes de la cabeza estén a la vista.

Sostenga una jeringa limpia en la mano derecha entre el pulgar y el índice. Apoye la parte inferior de la jeringa en el pulgar izquierdo, apoyada contra la placa Peltier. Mire a través del microscopio para asegurarse de que el bisel de la aguja sea visible.

Coloque el dedo índice izquierdo sobre la superficie de la cirugía de manera que forme un ángulo de 40 grados con el pulgar izquierdo para garantizar que la superficie permanezca estable durante el procedimiento. Coloque la aguja en un ángulo de 90 grados con respecto al ojo con el bisel de la aguja hacia arriba. Con la punta de la aguja, penetre suavemente en la fina capa de tejido que recubre la copa óptica del ojo, visible como una región blanca y sin pigmentar.

Con la cuchara de derecha a izquierda, elimine muy suavemente cualquier tejido pigmentado negro ubicado dentro de la copa óptica, así como todos los tejidos blancos. Si realiza una ablación de doble ojo, ablague el segundo ojo ahora. Después de completar la cirugía, cargue la pipeta con una pequeña cantidad de agua de lombriz y libere el agua sobre la lombriz para levantarla del papel de filtro.

Introduzca inmediatamente el gusano en la pipeta de transferencia. Mueva el gusano a una placa etiquetada de 12 pocillos, con dos tercios de agua fresca para el gusano. Una vez que se hayan transferido todas las lombrices, lávelas reemplazando el agua de los pozos con agua fresca para lombrices.

Incubar los gusanos protegidos de la luz en una incubadora a 20 grados centígrados y monitorear el proceso de regeneración. Para sacrificar gusanos vivos, retire el agua de gusano del plato y reemplácela con etanol al 70%. Incuba los gusanos durante tres a cinco minutos y observa si los gusanos se lisan y se vuelven grises.

Aquí se presentan fotografías de gusanos planos sometidos a ablación de doble ojo y ablación de un solo ojo, tomadas antes, cuatro días después y dos semanas después del procedimiento quirúrgico. Las imágenes muestran el progreso de la regeneración a lo largo del tiempo. La regeneración ocular en gusanos ablacionados también se confirmó mediante tinción inmunohistoquímica de arrestina y neuronas fotorreceptoras recientemente desarrolladas.

La recuperación del sistema visual en gusanos planos después de la doble ablación ocular también se estudió en un ensayo funcional basado en la respuesta fotofóbica de tipo salvaje a la luz. 24 horas después de la ablación, los gusanos sin ojos no evitan la luz y viajan a través de los puntos de luz. La fotofobia se restaura siete días después del procedimiento, lo que indica que el sistema visual regenerado es funcional.

Una vez dominado, el procedimiento de una ablación doble ocular de un gusano se puede realizar aproximadamente tres minutos. Al ablacionar, es importante extirpar todos los tejidos pigmentados y no pigmentados del ojo, asegurándose de no dañar el tejido entre los ojos o de desgarrar el tejido más tarde en el ojo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica y la interferencia de ARN para examinar el papel de genes específicos y su proceso regenerativo.

Además, se pueden realizar ensayos conductuales para evaluar la función ocular después del rebrote. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extirpar los ojos de las planarias sin alterar los tejidos circundantes. No olvide que trabajar con agujas puede ser peligroso, y se deben tomar precauciones como usar guantes y sostener la aguja apuntando en dirección opuesta a usted.