Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

El objetivo general de este procedimiento experimental es evaluar la patogénesis, las respuestas humorales y la eficacia de la protección inducida por los virus de la influenza A de tipo salvaje o las vacunas contra la influenza utilizando un modelo de infección en ratones. Este método puede ayudar a responder las preguntas sobre la biología de los virus de la influenza A, como la patogénesis viral, las respuestas inmunológicas y la eficacia de las vacunas contra la influenza, así como los antivirus. La principal ventaja de esta técnica es que el ratón tiene un sistema inmunológico similar al de los humanos y existen múltiples cepas que pueden ser explotadas para evaluar las bases genéticas de las infecciones por el virus de la influenza A.

Este método puede proporcionar información sobre la eficacia de las nuevas vacunas contra la gripe, también se puede aplicar a sistemas más antiguos, como la evaluación de posibles tratamientos antivirales, incluidos los anticuerpos o los fármacos. Después de criar y marcar ratones C57B6 de seis a ocho semanas de edad en condiciones libres de patógenos y preparar diluciones del virus de la influenza A o IAV en condiciones asépticas. Use una báscula para pesar a los ratones y registrar el peso.

Una vez que un ratón esté anestesiado y se haya verificado la profundidad de la anestesia de acuerdo con el protocolo de texto, colóquelo en decúbito dorsal. Inserte una punta de pipeta que contenga 30 microlitros del inóculo del virus en la fosa nasal y expulse la solución lenta pero constantemente. Para evaluar la morbilidad y la mortalidad, infecte tres o cuatro grupos de ratones hembra con 10 dosis completas de PR8 tipo salvaje como se describe en el protocolo de texto.

Controle y pese a los ratones durante los próximos 14 días, aproximadamente al mismo tiempo para minimizar las variaciones de peso debidas a la ingestión de alimentos. Después de sacrificar a los animales que sobrevivieron a la infección viral y calcular la dosis letal viral del 50% en ratones o MLD50 según el protocolo de texto. Infectar ratones hembra de seis a ocho semanas de edad con dosis virales de 10 a 10 a la cuarta unidad formadora de fluorescente o FFU de tipo salvaje PR8.

En los días dos y cuatro, recolectar los pulmones y la mucosa nasal del ratón para su evaluación. Después de sacrificar a los animales, coloque un animal en decúbito dorsal y use etanol al 70% para desinfectar el pelaje sobre el tórax. Use tijeras para cortar la piel desde la base del abdomen hasta el esternón.

Luego, con unas tijeras, haz cortes de un centímetro desde la base de la incisión hasta las partes laterales del ratón. Retire la piel de toda la parte superior del ratón hasta la base del abdomen donde se realizó la primera incisión. Luego use las tijeras para cortar la cabeza y colóquela en una placa de Petri seca y estéril.

Use unas tijeras para cortar las uniones entre el maxilar y la mandíbula y deseche la mandíbula. Luego, con las tijeras, haz dos cortes en los extremos de los arcos cigomáticos y retíralos. Use pinzas de disección para extirpar los ojos.

A continuación, con las pinzas de disección, sujete el cráneo y utilice un bisturí para cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital. Levante las dos mitades del cráneo con el cerebro para ver la mucosa nasal. Con el bisturí, corte la parte del cráneo con el cerebro y deséchelo.

Coloque el resto del cráneo con la mucosa nasal en un tubo estéril. Guarde el tubo en hielo si las muestras se procesan el mismo día o congele rápidamente en hielo seco si las muestras se procesarán más tarde. Para evitar la contaminación de las muestras, utilice desinfectante de dióxido de cloro, para limpiar y desinfectar las herramientas de disección entre cada tejido recuperado y entre cada disección animal.

Luego, para recoger los pulmones, coloque al animal en decúbito dorsal y use unas tijeras para cortar la plura. Comenzando en la base de la caja torácica, use unas tijeras para cortar las costillas un centímetro a ambos lados del esternón hasta la parte superior de las costillas. Haga una sección transversal con las tijeras entre las dos incisiones en la parte superior de la caja torácica y retire el lugar del pecho.

Sostenga los pulmones con las pinzas, haga una incisión en el extremo de la tráquea justo antes de los pulmones y coloque los pulmones en un tubo estéril. Coloque los pulmones o la mucosa nasal en un homogeneizador estéril y agregue un mililitro de medio para infecciones por resfriado. Homogeneice la muestra moviendo el mortero hacia arriba y hacia abajo durante aproximadamente un minuto a temperatura ambiente hasta que los pulmones estén completamente alterados.

Coloque la muestra homogeneizada en un tubo estéril. Centrifugar las muestras a 300 x G durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo estéril y deseche el pellet.

Almacene el sobrenadante a cuatro grados centígrados si la titulación viral se realiza el mismo día. El día antes de la valoración, siembre placas de 96 pocillos con células epiteliales MDCK en medio de cultivo de tejidos para que alcancen aproximadamente el 80 al 90% de confluencia. Incube las células en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante la noche.

Para preparar de una a 10 diluciones de las muestras homogeneizadas de pulmón o mucosa nasal, agregue 90 microlitros de medio de infección a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos. Añadir 10 microlitros del sobrenadante de una de las muestras homogeneizadas a los pocillos A1, A2 y A3, para evaluar el título viral de cada muestra y triplicar. A continuación, se añaden 10 microlitros de otro sobrenadante de las muestras homogeneizadas a los pocillos, A4, A5 y A6. Después de añadir el sobrenadante de muestra a la fila A, utilice una pipeta multicanal para mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Transfiera 10 microlitros de la fila A a la fila B y mezcle bien. Cambie las puntas entre diluciones y repita la transferencia de la fila B a la fila C y continúe de manera similar hasta llegar a la última fila, H. Usando un adaptador multicanal de aspirador de vacío, retire el medio de cultivo de tejidos de las celdas MDCK en las placas de 96 pocillos y use 100 microlitros por pocillo de 1x PBS para lavar las celdas dos veces. Comenzando con las diluciones más altas y pasando a las diluciones más bajas, transfiera 50 microlitros por pocillo del sobrenadante diluido en serie de las muestras homogeneizadas a la placa de 96 pocillos de las celdas MDCK, transfiriendo las diluciones más altas de la fila H a la fila A de celdas.

Coloque la placa de 96 pocillos en una plataforma mecedora durante una hora a temperatura ambiente para permitir la absorción viral. A continuación, utilizando un adaptador multicanal de aspirador de vacío, retire el inóculo y añada 100 microlitros por pocillo de medio post infección. Incubar las células infectadas durante ocho horas en una incubadora a 33 grados centígrados o 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Proceda a la fijación, tinción, obtención de imágenes y cálculo del título viral como se describe en el protocolo de texto. En este experimento, los ratones fueron infectados con diferentes dosis de PR8 tipo salvaje. Se midió el peso corporal y la supervivencia de cinco ratones por grupo durante 14 días después de la infección.

Los ratones inmunizados con FFU más altos de tipo salvaje PR8, perdieron peso más rápida y severamente y todos murieron como resultado. El MLD50 de tipo salvaje PR8 en este experimento, calculado con el método de caña y muench fue de 1.5 x 10 a la segunda FFU. Para analizar las respuestas humorales inducidas contra la infección IV, 14 días después de la inmunización, se sangró a ratones para analizar la presencia de anticuerpos contra las proteínas virales totales y la presencia de anticuerpos neutralizantes dirigidos a la proteína HA viral, utilizando una inhibición de la hemoaglutinación o HAI y un ensayo de microneutralización del virus o VN.

Como se ve aquí, los resultados del ensayo indican que los sueros de los ratones inmunizados con una dosis más alta del virus de la influenza vivo atenuado PR8 o LAIV tenían títulos de anticuerpos más altos contra las proteínas PR8 totales que los sueros de los ratones inmunizados con una dosis más baja. Utilizando los ensayos HAI y VN, los sueros de los ratones con la mayor cantidad de PR8 LAIV tenían un título más alto de anticuerpos neutralizantes, mientras que el suero de un ratón inmunizado con la dosis más baja tenía el título más bajo de anticuerpos neutralizantes contra PR8. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo infectar ratones con los virus de la influenza A, cómo evaluar por su patogénesis, respuestas humorales e inmunitarias y biorreplicación en el tracto respiratorio superior e inferior.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del virus de la influenza A exploraran la patogenicidad, inmunogenicidad y eficacia de protección de las vacunas de anticuerpos vivos, utilizando un modelo de infección en ratones.