Name: Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a evaluar la patogénesis del virus influenza A y la eficacia de vacunas usando un modelo murino C57B6. Este método permite estudiar respuestas inmunes y desarrollar tratamientos antivirales.

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Investigación sobre el virus de la gripe en laboratorio LM-S es financiada parcialmente por la Nueva York Influenza centro de excelencia (NYICE), miembro de la NIAID centros de excelencia para la investigación de la Influenza y vigilancia (CEIRS). Agradecemos a Wendy Bates por su apoyo en las correcciones del manuscrito.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de ratón de IAV es ampliamente utilizado en vivo estudios de eficacia IAV patogenesia, inmunogenicidad y protección. El pequeño tamaño de los ratones los hace fáciles de manipular y almacenar en comparación con otros modelos animales tales como hurones o cobayas. Además, la facilidad en términos de costo de animal, alojamiento y reproducción permiten su uso en pruebas de vacunación pre clínicos en los que se necesitan grandes cantidades de animales. En particular, ya que los ratones se han utilizado en...

Gripe es virus envueltos, clasificados en la familia de Orthomyxoviridae 3. Contienen ocho moléculas de ARN monocatenario con polaridad negativa3. En los seres humanos, gripe causa epidemias estacionales y pandemias ocasionales de consecuencia importante cuando se introducen nuevos virus en la población humana4. Por otra parte, gripe estacional es altamente y rápidamente transmitida entre los seres humanos produciendo una elevada pérdida económica en todo el mundo cada año2,5. IAV los síntomas incluyen tos, congestión nasal, fiebre, malestar general, cefalea, anorexia y mialgias, pero el virus también puede producir una enfermedad más severa en pacientes inmunocomprometidos6. De hecho, la Organización Mundial de la salud (OMS) calcula que el virus de la gripe estacional causan 300.000-500.000 muertes en todo el mundo cada año1. Hay sólo dos clases de medicamentos actualmente aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) para la profilaxis de la gripe y tratamiento en seres humanos: inhibidores de la neuraminidasa (NA) (p. ej., oseltamivir) y bloqueadores del canal iónico M2 (p. ej., amantadina); sin embargo, la aparición de variantes del virus resistentes a los medicamentos es una preocupación cada vez mayor. Vacunación, por lo tanto, sigue siendo la mejor opción médica para proteger a los seres humanos contra las infecciones de gripe. Hasta la fecha, tres tipos de influenza hay vacunas aprobadas por la FDA para el uso humano: las vacunas de proteínas recombinantes virales hemagglutinin (HA), inactivadas vacunas contra la influenza (IIV) y viva atenuada de influenza vacunas (LAIV)5, 7. las tres vacunas están diseñadas para inducir la respuesta inmune adaptativa contra la proteína viral de la HA, el objetivo principal de neutralizar anticuerpos contra la gripe.
Un modelo de ratón validado para el estudio de infección de IAV en vivo
Se han utilizado modelos animales para estudiar, entre otros, IAV patogenesia8,9,10,11, factores virales que contribuyen a la enfermedad12 o transmisión viral13 ,14, y probar la eficacia de nuevas vacunas o antivirales fármacos9,10,15. Ratones (Mus musculus) son el modelo animal más ampliamente utilizado para la investigación IAV por varias razones: 1) el sistema inmune es evolutivamente similar al que presentan en los seres humanos; compra animal de bajo costo, incluyendo 2), la vivienda y la reproducción; 3) pequeño tamaño fácilmente manipular y almacenar; 4) variabilidad de host mínimo para obtener respuestas homogéneas y resultados; 5) un gran conocimiento de la biología de ratones, incluyendo la secuencia del genoma; 6) muchos disponible biología molecular y/o reactivos de Inmunología; 7) disponible knock out (KO) de ratones para estudiar la contribución de una proteína huésped dado en infección viral; y, 8) múltiples cepas de ratón que pueden ser aprovechadas para evaluar las bases genéticas de las infecciones.
Hay varias cepas de ratón disponibles actualmente para el estudio de IAV en vivo. Edad, estado inmunitario, sexo, cepa genética de fondo y el ratón, así como rutas de infección, dosis y cepas del virus de influyen en el resultado de la infección del IAV en ratones. Las cepas de ratón más comunes utilizadas en la investigación IAV son C57BL/6, BALB/C y, más recientemente, DBA.2 ratones ya que son más susceptibles a la enfermedad IAV que dos cepas anteriores16,17,18, 19 , 20. lo que es importante, la respuesta inmune también puede ser diferente dependiendo de la cepa de ratón18,19,20. Por lo tanto, es muy importante recuperar toda la información disponible sobre el ratón y la cepa IAV a elegir la mejor opción para el experimento a realizarse.
Aunque el ratón es un buen modelo animal de infección para los estudios en vivo IAV, tienen varias limitaciones, que deben considerarse en el diseño experimental. Por ejemplo, una limitación importante de la utilización de ratones en vivo estudios es que la gripe no transmite entre ratones. Así, para la transmisión de los estudios, más aceptado modelos animales (e.g., hurones o cobayas) son usados16,17,21. Además, hay varias diferencias entre las manifestaciones del IAV en ratones y seres humanos. A diferencia de los seres humanos, ratones no desarrollan fiebre con infección de IAV; por el contrario presentan hipotermia16,17. En ratones, replicación de IAV se concentra en el tracto respiratorio inferior (pulmones) en lugar de las vías aéreas superiores. Por lo tanto, virulencia del IAV en ratones no se correlaciona siempre al que se observa en los seres humanos. En conjunto, ya que las ventajas compensan las desventajas limitadas, ratón representa el primer modelo animal para evaluar patogenesia viral gripe, inmunogenicidad y eficacia protectora en los estudios de vacunas y antivirales. Por otra parte, no sería éticamente aceptable para llevar a cabo estudios con IAV usando modelos animales grandes sin pruebas previas en un pequeño modelo animal de infección IAV. En este manuscrito, describimos cómo infectar ratones intranasal (i.n.) con IAV, cómo controlar la severidad y progreso de la infección viral y cómo llevar a cabo los experimentos necesarios para evaluar la respuesta inmune humoral y la eficacia de protección.

<table><tbody><tr><td>Células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK)</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>Ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad</td><td>Instituto Nacional del Cáncer (NCI)</td><td>01XBE</td><td></td></tr><tr><td>Células rojas de Turckey</td><td>Biolink Inc</td><td></td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Tienda a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Tienda en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Tienda en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Bovin Solución de albúmina (BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Tienda a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Bovin Albúmina sérica (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Tosilsulfonil fenilalanil clorometilcetona tratada (TPCK) con tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Almacene en -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra 10%</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-NP Virus de la influenza A HB-65</td><td>ATTC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>Tienda en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Inmunoglobulinas policlonales anti-ratón de conejo/FITC</td><td>Dako</td><td>F0261</td><td>Almacenar en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>ECL Anti-ratón IgG, anticuerpo entero ligado a la peroxidasa de rábano picante</td><td>GE Healthcare LNA931V</td><td>/AG</td><td>Tienda en 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Juego de sustratos TMB</td><td>BioLegend</td><td>421101</td><td>Almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Vmax Lector de placas cinéticas</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinders</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Enzima destructora de receptores, RDE (II)</td><td>Denka Seiken Co.</td><td>370013</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Violeta</td><td>Cristal Fisher Scienctific</td><td>C581-100</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular 100 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell Microplacas de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scienctific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Poliestireno de 96 pocillos Placas MicroWell de</td> <td>fondo cónicoThermo Fisher Scienctific</td><td>249570</td><td></td></tr><tr><td>Puralub Vet Opomada</td><td>Dechra</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX81</td><td></td></tr></tbody></table>

estudios de virus de influenza a en un modelo murino de infección

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Virus de la influenza causan más de 500.000 muertes en todo el mundo1 y se asocian con un costo anual de US $ 12 billones en los Estados Unidos solo considerando médica directa y gastos de hospitalización y ausentismo de trabajo2. Modelos animales son cruciales en los estudios de Influenza A virus (IAV) evaluar patogenesia viral, interacciones huésped-patógeno, respuesta inmune, y la eficacia de la vacuna actual o nuevos enfoques así como antivirales. Los ratones son un modelo animal pequeño ventajoso porque su sistema inmunológico es evolutivamente similar a ése encontrado en los seres humanos, están disponibles de proveedores comerciales como sujetos genéticamente idénticos, existen múltiples cepas que pueden ser aprovechadas para evaluar la base genética de las infecciones, y son relativamente baratas y fáciles de manipular. Para recapitular la infección IAV en los seres humanos a través de las vías respiratorias, ratones primero son anestesiados antes de la inoculación intranasal con gripe infecciosa bajo contención de bioseguridad adecuado. Después de la infección, la patogenesia de la gripe se determina mediante el control diario de la morbilidad (pérdida de peso corporal) y la tasa de mortalidad (supervivencia). Además, patogenesia viral también puede evaluarse mediante la evaluación de replicación del virus en la parte superior (mucosa nasal) o tracto respiratorio (pulmones) inferior de ratones infectados. Las respuestas humorales sobre infección de IAV pueden rápidamente evaluar sangrado no invasiva y la detección del anticuerpo secundario ensayos destinados a detectar la presencia de total o anticuerpos neutralizantes. Aquí, describimos los métodos comunes utilizados para infectar ratones intranasal (i.n) con IAV y evaluar patogénesis, respuesta inmune humoral y eficacia de protección.

Caracterización de la patogenesia viral en ratones
La patogenesia de IAV se relaciona con la morbilidad y la mortalidad causada por la infección. Estos dos parámetros pueden evaluarse fácilmente en ratones: morbilidad IAV se asocia con pérdida de peso corporal en ratones infectados y el porcentaje de supervivencia indicará la tasa de mortalidad (figura 1). El peso corporal y la supervivencia en ratones...

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es evaluar la patogénesis, las respuestas humorales y la eficacia protectora inducidas por virus salvajes de Influenza A o por vacunas contra la Influenza utilizando un modelo de infección en ratones. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la biología de los virus de Influenza A, tales como la patogénesis viral, las respuestas inmunitarias y la eficacia de las vacunas contra la Influenza, así como de los antivirales. La principal ventaja de esta técnica es que el ratón posee un sistema inmunitario similar al de los humanos y existen múltiples cepas disponibles que pueden aprovecharse para evaluar la base genética de las infecciones por el virus de la Influenza A.Dado que este método puede proporcionar información sobre la eficacia de nuevas vacunas contra la influenza, también puede aplicarse a sistemas más antiguos, como la evaluación de posibles tratamientos antivirales, incluyendo anticuerpos o fármacos. Después de criar y marcar ratones C57B6 de seis a ocho semanas de edad en condiciones libres de patógenos y preparar diluciones del virus de la influenza A o IAV en condiciones asépticas, utilice una balanza pa

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una infección concurrente con el virus de la influenza es uno de los factores implicados en la inducción de la enfermedad neumocócica invasiva en...

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

Fuente: Lenhard, A. et al. Un modelo murino para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad agravada por la edad. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo muestra un modelo de coinfección en ratones en el que el virus de la gripe desencadena la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno. Detalla los pasos implicados en la colonización bacteriana, la infección viral y la progresión de la enfermedad.

Un modelo murino para estudiar la transición patógena de Streptococcus pneumoniae tras la coinfección viral

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Este video muestra un método para rastrear infecciones virales en modelos de ratón utilizando un virus de influenza A bi-reportero que expresa luciferasa y proteínas de fluorescencia. Este método permite realizar estudios tanto in vivo como ex vivo, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la dinámica viral y los efectos de las intervenciones.

Un virus de la influenza indicador fluorescente de luciferasa para rastrear infecciones virales

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Se demuestran modelos de infección sistémica y localizada del pez cebra por el virus de la influenza A humana. Utilizando un modelo de infección sistémica, el pez cebra se puede utilizar para detectar medicamentos antivirales. Utilizando un modelo de infección localizada, el pez cebra puede utilizarse para caracterizar las respuestas de las células inmunitarias del huésped.

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

Los virus de la gripe A son patógenos respiratorios contagiosos que causan epidemias anuales y pandemias ocasionales. Aquí, describimos un protocolo para rastrear infecciones virales in vivo usando una nueva luciferasa recombinante y bi-reportero expreso de fluorescencia IAV (BIRFLU). Este enfoque proporciona a los investigadores una excelente herramienta para estudiar IAV in vivo.

Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral

Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

Este artículo describe un nuevo modelo de ratón para la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Este modelo se puede adaptar fácilmente para estudiar las interacciones polimicrobianas y huésped-patógeno durante las diferentes fases de la progresión de la enfermedad y entre varios huéspedes.

Un modelo de ratón para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad exacerbada por la edad

Este protocolo proporciona instrucciones para la administración intranasal de IAV y el análisis posterior del daño pulmonar del ratón y los cambios transcripcionales asociados a los tipos de células pulmonares.

Modelado de la reparación alveolar pulmonar displásica y funcional después de la infección por influenza

Aprende a evaluar la patogénesis del virus influenza A y la eficacia de vacunas usando un modelo murino C57B6. Este método permite estudiar respuestas inmunes y desarrollar tratamientos antivirales.

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

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