En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser

Los objetivos generales de este procedimiento son utilizar la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y la oftalmoscopia láser de barrido para obtener información sobre el grosor de la retina y la distribución de las células microgliales, respectivamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología experimental sobre la correlación entre las anomalías de la retina y la acumulación de células microgliales. Las principales ventajas de esta técnica son que esta información se puede obtener en tiempo real de forma no invasiva.

Después de confirmar la falta de respuesta al hisopado corneal, coloque el ratón en posición prona en el lado izquierdo de la plataforma, con la órbita derecha mirando hacia la lente. Aplique una gota de hidroxipropilmetilcelulosa en una lente de contacto rígida permeable al gas de más cuatro dioptrías en el ojo derecho e inicie el módulo de adquisición. Para las exploraciones B, seleccione la opción Tomografía de coherencia óptica más infrarroja En Aplicación y estructura, seleccione Retina y utilice el micromanipulador para mover la lente hacia el ojo del ratón.

Antes de enfocar en la retina, confirme que el indicador Oculus Dexter está seleccionado, luego use la perilla de enfoque para acercar la retina hasta que los vasos grandes sean claramente visibles en la imagen del fondo de ojo en el lado izquierdo de la pantalla del monitor. Utilice el micromanipulador para ajustar la posición de la cámara, según sea necesario, girando la perilla de sensibilidad para reducir o aumentar el brillo de la imagen del fondo de ojo, según corresponda. Seleccione el escaneo de línea en el menú Patrón y use el micromanipulador para mover el escaneo B entre las esquinas superior e inferior de la ventana de escaneo de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, o SD-OCT.

Establezca el valor de Tiempo real automático en al menos nueve para obtener una alta calidad de imagen y haga clic en Adquirir. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, transfiera la lente de contacto del ojo a una solución salina fresca y equilibrada e hidrate la córnea con una gota fresca de hidroxipropilmetilcelulosa. Una vez que se haya obtenido la imagen del ojo izquierdo, gire la óptica estándar de 30 grados en el sentido contrario a las agujas del reloj para quitarla y monte la lente de 55 grados para una segunda ronda de imágenes.

Para evaluar la autofluorescencia, sin mover el ratón, seleccione Infrarrojo en el panel de control y concéntrese en los grandes vasos de la retina. Seleccione la imagen de fluorescencia automática y use la perilla de sensibilidad para ajustar el brillo de la imagen, según sea necesario. Presione la perilla de sensibilidad una vez y establezca el valor automático en tiempo real en al menos 67.

Cuando se haya alcanzado el valor automático en tiempo real, adquiera la imagen y presione la perilla de sensibilidad por segunda vez para detener el promedio. Ajuste el enfoque para visualizar las diferentes capas de la retina, según sea apropiado experimentalmente. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, se pasa a una lente de campo amplio de 102 grados a la óptica y se obtiene la imagen de la autofluorescencia en cada ojo, como se acaba de demostrar.

Para medir el grosor manual de la retina en cada imagen, haga doble clic en el nombre del primer animal de experimentación para abrir la OCT, abra una exploración B obtenida con la lente de 30 o 55 grados y seleccione el perfil de grosor. Haga clic en el icono Editar segmentaciones de capas.

El software identificará automáticamente las membranas limitantes y de base internas. Para corregir manualmente la posición de las membranas, seleccione la capa a modificar, así como la opción de círculo rojo. Manteniendo pulsado el botón del ratón, mueva el círculo para modificar la línea hasta que la capa correspondiente esté correctamente colocada y haga clic en Guardar y cerrar para salir de la ventana.

En la opción Capa, seleccione Retina y haga clic en una posición diferente en el diagrama para ver el grosor de la retina para la posición seleccionada. A continuación, mida el grosor de la retina y la distancia deseada desde la cabeza del nervio óptico y exporte los valores a una hoja de cálculo. En estas exploraciones individuales SD-OCT representativas de un homocigoto de ratón para la expresión de gfp bajo el promotor Cx3cr1, la arquitectura de la retina se visualiza claramente en las imágenes de lente de 30 grados y 55 grados.

Sin embargo, se observa una alta reflectividad de la coroides en las exploraciones obtenidas con la lente de 30 grados. Después de la SD-OCT, la oftalmoscopia láser de barrido permite la visualización de las células microgliales individuales gfp positivas en la retina utilizando una lente de 55 grados o una de 102 grados con una mayor cobertura del área del fondo de ojo obtenida con la lente de 102 grados. En las exploraciones SD-OCT, después de la corrección manual de los límites internos y de la membrana base de la retina, se observa típicamente una buena correlación de la medición del grosor de la retina entre las lentes de 30 y 55 grados cuando se mide la misma distancia desde la cabeza del nervio óptico.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de cincuenta minutos si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores del campo de la oftalmología experimental exploraran la patología de la retina en pequeños roedores in vivo.