In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

El objetivo general de este protocolo es evaluar la fagocitosis de macrófagos derivados de la médula ósea de los restos de mielina derivados del cerebro. Este protocolo está diseñado para responder preguntas clave en el campo del neurotrauma. La ventaja de este método es que permite un análisis eficiente y relativamente rentable de las respuestas de los macrófagos in vitro, específicamente la capacidad fagocítica de los macrófagos derivados de la médula ósea para los restos de mielina.

Este método se puede adaptar fácilmente para investigar los efectos de los moduladores externos. Después de haber saturado el ratón con etanol al 70%, haga una abertura en la piel abdominal. Tira de la piel hacia atrás para revelar las patas para la disección.

Tenga cuidado de no perforar la cavidad peritoneal durante este proceso. Una vez expuestas, retira las piernas cortando el tobillo y la cadera. Coloque las piernas en PBS helado complementado con antibióticos.

Lave el tejido con PBS fresco y helado suplementado con antibióticos para desalojar cualquier partícula que pueda haberse adherido al tejido durante la disección. Un suave movimiento de raspado aplicado a lo largo del músculo desalojará la mayor parte del tejido no deseado.

Con un bisturí y pinzas, libere la tibia del músculo y el tejido conectivo. Una vez liberado, retire ambos extremos para exponer la cavidad de la médula. Repite este proceso para el fémur.

Coloque una aguja de calibre 25 en una jeringa de 20 milímetros llena de medios macrófagos completos derivados de la médula ósea. A continuación, enjuague la cavidad de la médula ósea. El hueso aparecerá blanco cuando esté lo suficientemente enjuagado.

Agite los aspirados de médula recolectada con una aguja de calibre 18 durante 30 a 90 segundos para obtener una suspensión de una sola célula. A continuación, pase la suspensión a través de un colador de células estéril de 70 micrómetros del tamaño de un poro. Divida uniformemente las suspensiones celulares en placas de cultivo celular de 145 centímetros.

Cada ratón proporcionará suficiente para un total de tres platos. Después de siete días de cultivo, estos platos suelen tener entre un 70 y un 80% de confluentes con macrófagos maduros. Para aislar los restos de mielina cruda de los cerebros, se llevan a cabo una serie de pasos de ultracentrifugación en gradiente de sacarosa.

Para empezar, se diseccionan de 10 a 12 cerebros de ratones de ocho a 10 semanas de edad. A continuación, los cerebros se homogeneizan en una solución de sacarosa 0,32 molar y luego se colocan en capas sobre una almohadilla de solución de sacarosa 0,383 molar para crear un gradiente discontinuo. Después de la centrifugación, los restos de mielina cruda se encuentran en la interfaz entre las capas.

Esto se recoge y se dispensa en una solución tampón Tris y se centrifuga de nuevo para pellets los restos de mielina. El pellet se vuelve a suspender en una solución tampón de Tris y se divide en dos tubos para una cenetrifugación adicional. Para empezar, retira todo el cerebro y colócalo en un plato con una solución helada de sacarosa 0,32 molar.

Con unas tijeras quirúrgicas estériles, corte los cerebros recolectados en pedazos de aproximadamente cinco milímetros de tamaño. Este paso ayuda en el proceso de homogeneización posterior. Recoja el pañuelo en un tubo de 50 mililitros.

Con un homogeneizador rotativo, homogeneice el tejido hasta convertirlo en una suspensión suave. Asegúrese de que todos los sólidos cerebrales grandes visibles se hayan homogeneizado completamente. En un tubo de ultracentrífuga que contiene 20 mililitros de solución de sacarosa 0,83 molar, generar y homogeneizar, teniendo cuidado de mantener la separación.

Equilibre cuidadosamente cada tubo con la solución de sacarosa 0,32 molar. Una vez terminado, transfiera los tubos a un rotor centrífugo apropiado y haga girar durante 45 minutos a 100.000 veces la gravedad, cuatro grados centígrados. Asegúrese de que la aceleración y la desaceleración se establezcan en sus valores mínimos.

Una vez completada la centrifugación, los restos de mielina serán visibles entre la interfaz de densidad de sacarosa. Recoja con cuidado los restos de mielina. Una vez recolectado, agregue tampón Tris a los restos de mielina.

Homogeneizar de nuevo con un homogeneizador rotativo. Divida el homogeneizado entre seis tubos de ultracentrífuga limpios y equilibre los tubos según sea necesario con tampón Tris adicional. Centrifugar los restos de mielina recolectados nuevamente a 100.000 veces la gravedad, cuatro grados Celsius durante 45 minutos, con la aceleración y la desaceleración ajustadas a sus valores máximos.

Después de la centrifugación, la mielina habrá sido granulada. Con el tampón Tris, vuelva a suspender el pellet. Combine las resuspensiones y la ultracentrífuga nuevamente.

Después de la centrifugación, se forma un pellet muy apretado. Decantar el supernadar. Vuelva a suspender el pellet en PBS estéril.

Divida equitativamente los restos de mielina resuspendida en tubos de microcentrífuga previamente pesados. Después de la centrifugación durante 10 minutos a 22.000 veces la gravedad, retire el supernato de PBS. Después de pesar el pellet, vuelva a suspender a una concentración de 100 miligramos por mililitro con PBS.

Los restos de mielina cruda resultantes son ahora adecuados para el estudio de la fagocitosis. Los residuos de mielina de marcado CFSE se pueden utilizar para rastrear la internalización temprana, así como el tráfico intracelular. Los restos de mielina sin marcar son compatibles con la tinción lipídica Oil Red-O para evaluar el almacenamiento y el metabolismo de los lípidos internalizados.

Si está utilizando restos de mielina que se han almacenado a menos 80 grados centígrados, primero querrá volver a suspender con una aguja de calibre 29. Vuelva a suspender 10 miligramos de restos de mielina peletizada en 200 microlitros de PBS. A continuación, añada dos microlitros de solución de CFSE de cinco milimolares.

Pipeta para mezclar. Después de una incubación de 30 minutos, protegido de la luz y del lavado posterior, vuelva a suspender los restos de mielina a 100 miligramos por mililitro con PBS. Después del cultivo y la fijación con paraformaldehído al 4%, agregue 100% de propilenglicol a cada pocillo.

Después de incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, agregue la solución de tinción Oil Red-O a cada pocillo. Incubar durante ocho minutos a 60 grados centígrados con una agitación suave. Incline suavemente la placa para permitir la aspiración completa de la mancha Oil Red-O.

A cada pocillo agregue un 85% de propilenglicol. Después de cinco minutos de incubación a temperatura ambiente, lave los pocillos con PBS y tiña las células con el colorante nuclear de su elección. Imágenes representativas de microscopía óptica de células de médula ósea durante el cultivo.

24 horas después de la siembra inicial, hay pocas células adherentes presentes. Sin embargo, en presencia del factor estimulante de colonias de macrófagos, M-CSF, las células precursoras de leucocitos comienzan a diferenciarse. Después de siete días de cultivo en presencia de M-CSF, las células precursoras se diferencian completamente en macrófagos maduros derivados de la médula ósea capaces de fagocitosis.

Con este método, un solo ratón C57 negro 6J de ocho a 10 semanas de edad normalmente producirá de 18 a 24 millones de macrófagos de médula ósea. Para visualizar la internalización, se añaden restos de mielina marcados con CFSE a los cultivos de macrófagos derivados de la médula ósea. Las células se trataron con un miligramo por mililitro de restos de mielina marcados con CFSE durante una hora antes del lavado y la fijación con paraformaldehído al 4%.

Los restos de mielina internalizados se pueden visualizar utilizando conjuntos de filtros GFP estándar en un microscopio con capacidad epifluorescente. Para demostrar cómo cambia la acumulación de lípidos de mielina con el tiempo, los macrófagos se trataron con restos de mielina no marcados durante 90 minutos, luego se lavaron y fijaron en varios puntos temporales. Inmediatamente después del lavado, se ven pocas gotas de lípidos.

Sin embargo, a medida que pasa el tiempo, se hacen visibles más gotas de lípidos, alcanzando un máximo aproximadamente 24 horas después del lavado. Los macrófagos comenzarán a metabolizar para obtener flujo a las reservas de lípidos, reduciendo el número de gotas teñibles. Para cuantificar la tinción de Oil Red-O, se obtuvieron cinco imágenes aleatorias de cada muestra de punto de tiempo utilizando un microscopio con capacidad epifluorescente.

El área teñida de petróleo rojo O para cada pozo se determinó utilizando imágenes capturadas en el canal DsRed. El número total de células se determina contando el número de núcleos presentes en cada campo. Este gráfico muestra la cuantificación resultante.

Es típico un aumento constante en la señal positiva de aceite Red-O, ya que los macrófagos derivados de la médula ósea convierten los lípidos de mielina internalizados en lípidos neutros. Una disminución en la señal positiva de aceite Red-O sigue al pico a las 24 horas cuando los macrófagos comienzan a metabolizar o expulsar los lípidos. Después de haber visto este video, debería tener una buena idea de cómo aislar y cultivar macrófagos primarios derivados de la médula ósea, así como de cómo estudiar su interacción con los desechos de mielina derivados del cerebro recién aislados.

La parte más importante de estos procedimientos es el mantenimiento adecuado de la técnica aséptica en todo momento. Debido a que los macrófagos pueden responder de manera robusta a pequeñas cantidades de moléculas asociadas a patógenos, es fundamental minimizar cualquier interacción potencial que pueda sesgar los resultados. La principal ventaja de estas técnicas es que nos hacen partir de células primarias biológicamente relevantes y restos de mielina fresca, al tiempo que eliminan la cantidad de equipo especializado necesario.

Además, con cierta optimización por parte del usuario, estos métodos se pueden adaptar fácilmente para abordar una amplia variedad de preguntas sobre la respuesta de los macrófagos derivados de la médula ósea a los restos de mielina. Mediante el uso de restos de mielina marcados con fluorescencia y la tinción con Oil Red-O de macrófagos mielinizados, es posible investigar posibles intervenciones terapéuticas para pacientes que sufren una variedad de neurotraumatismos. El objetivo general de este trabajo es la eliminación remota de residuos celulares mediada por macrófagos para promover la resolución de la inflamación.