Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en Drosophila Embriones

El objetivo general de este procedimiento es medir la fagocitosis in vivo en Drosophila para evaluar la participación de genes específicos de interés en la envuelta de células apoptóticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la biología del desarrollo sobre los mecanismos implicados en la absorción de células apoptóticas. La principal ventaja de esta técnica es que las células se pueden utilizar de forma fácil y precisa, midiendo los niveles de fagocitosis in vivo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de los trastornos inflamatorios y las enfermedades autoinmunes, ya que la célula apoptótica por fagocitosis es necesaria para eliminar las células peligrosas que causan inflamación. Comience agregando 200 moscas de la fruta hembra adultas y 200 machos adultos y un plato de agar jugo de uva fresco sobre levadura en un tubo cónico de 50 mililitros. Cierre el tubo con una tapa de esponja e incube las moscas a la luz a 16 grados centígrados durante dos o tres días.

Al final de la incubación, mueva las moscas a 25 grados centígrados en la oscuridad durante una hora y reemplace la placa vieja por una nueva placa sin levadura. Deja que las moscas pongan huevos durante dos horas. A continuación, incubar la placa a 16 grados centígrados durante 26 horas.

Al día siguiente, use un pincel para transferir los embriones a un mililitro de PBS suplementado con 0.2% de Triton X-100. Después de dos lavados, agregue 1,2 mililitros de solución de hipoclorito de sodio a los embriones para eliminar el corion. Después de tres minutos, lave los embriones cuatro veces en PBS fresco más Triton X-100.

Transfiera los embriones lavados a una placa de agarosa de seis centímetros y coloque la placa bajo un microscopio de disección. Identifique los embriones en etapa 16 usando una micropunta. Utilice una micropipeta para transferir aproximadamente 50 de los embriones de la etapa 16 a un microtubo de ensayo de 1,5 mililitros.

Para aislar las células embrionarias, primero se lavan los embriones dos veces con 150 microlitros de PBS. Transfiera los embriones a un nuevo microtubo de ensayo de 1,5 mililitros. A continuación, añadir 200 microlitros de colagenasa y homogeneizar los embriones 30 veces con un mezclador de pellets.

Al final de la homogeneización, triture las células embrionarias 10 veces y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Incuba las células a 37 grados centígrados durante un minuto. Luego triture las células 10 veces más y devuélvalas a la incubadora a 37 grados centígrados durante un minuto más.

Al final de la segunda incubación, agregue 800 microlitros de PBS a las células y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tripsina antes de filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micras. Detenga la actividad enzimática con 40 microlitros de suero fetal bovino inactivado por calor en 800 microlitros de PBS y recoja las células por centrifugación.

Resuspender las células precipitadas en 200 microlitros de PBS fresco y recoger las células con otra centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 30 microlitros de PBS y monte las células en un portaobjetos de vidrio recubierto de aminopropiltrietoxisilano. Cuando las células se hayan adherido, utilice una pipeta para eliminar el exceso de PBS del portaobjetos y fije las células con 60 a 70 microlitros de paraformaldehído al 4%.

Después de 10 a 15 minutos, retire el fijador y lave las células en PBS durante un minuto. Para inmunoteñir las células con el anticuerpo anti-Croquemort, primero remoje el portaobjetos en metanol en serie, luego PBS suplementado con Triton X-100 al 0,2% seguido de PBS solo. A continuación, bloquee la unión inespecífica con 20 microlitros de suero porcino entero al 5% en PBS más 0,2%Triton X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Retire el exceso de solución bloqueante y etiquete las células con 20 microlitros de antisuero anti-Croquemort a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave el portaobjetos en PBS más Triton X-100 durante cinco incubaciones de 10 minutos. Después del último lavado, enjuague el portaobjetos en PBS durante 10 minutos.

A continuación, etiquete las células con 20 microlitros de IgG anti-rata marcada con fosfatasa alcalina a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, lave el portaobjetos cinco veces en PBS más Triton X-100, como se ha demostrado, seguido de un remojo de 10 minutos en una solución tampón. A continuación, etiquete las células con una solución de sustrato de fosfatasa y observe las células bajo un microscopio óptico.

Cuando aparezcan señales púrpuras fuertes en los gránulos de hemocitos, retire el exceso de sustrato y remoje el portaobjetos en tampón suplementado con EDTA durante cinco a 10 minutos. Al final de la incubación, enjuague las células con dos lavados de PBS de cinco minutos y trátelas con tampón de equilibrio durante 10 minutos. Después de retirar la solución, etiquete las células con 20 microlitros de solución terminal de desoxinucleotidil transferasa a 37 grados centígrados durante una hora.

A continuación, retire la solución del portaobjetos y sumerja las células en un tampón de parada de 0,5 mililitros en 17 mililitros de agua durante 10 minutos. A continuación, enjuague las células con tres lavados de PBS de cinco minutos y etiquételas con 20 microlitros de peroxidasa anti-digoxigenina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las células cuatro veces en PBS como se ha demostrado y remoje el portaobjetos en sustrato de peroxidasa durante incrementos de 30 segundos hasta que las células apoptóticas se vuelvan marrones.

Cuando se haya logrado una tinción óptima, remoje el portaobjetos en agua para detener la reacción de la peroxidasa. En estas imágenes, los macrófagos de Drosophila llamados hemocitos fueron teñidos para el marcador de hemocitos Croquemort y para la presencia de células apoptóticas fagocitadas por TUNEL en células embrionarias dispersas como se acaba de demostrar. Las células positivas de Croquemort exhiben señales púrpuras en los pequeños gránulos de sus células, mientras que las células positivas de TUNEL mostraron señales marrones en sus corpus completos.

Alternativamente, los hemocitos se pueden teñir con un anticuerpo anti-GFP que tiñe todo el hemocito en lugar de solo los gránulos. En este experimento, se analizó la proporción de hemocitos fagocitadores con respecto al total de hemocitos en embriones de tipo salvaje o mutantes únicos, demostrando que el índice fagocítico fue menor en ambas cepas mutantes individuales que en moscas de tipo salvaje, mientras que el número total de hemocitos y células apoptóticas fue similar, lo que indica el requerimiento de los genes mutados para la engullimiento de células apoptóticas. La eliminación de ARNi de genes individuales también reduce el índice fagocítico, mientras que el número total de hemocitos y células apoptóticas permaneció comparable, lo que subraya aún más la participación de los receptores de fagocitosis investigados en la fagocitosis mediada por células apoptóticas.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas 15 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar el exceso de marcadores de hemocitos y la tinción de TUNEL para una evaluación óptima de la capacidad fagocitótica de las células. Después de este procedimiento, se puede realizar un ensayo de fagocitosis in situ de todos los embriones de Drosophila para responder preguntas adicionales sobre el sitio de engullido o la distribución de los hemocitos.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran los mecanismos de engullimiento de células apoptóticas en Drosophila. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la fagocitosis in vivo en embriones de Drosophila.