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Introducción sobre endocitosis y exocitosis

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Cell Biology

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An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

4.6: Invasion Assay Using 3D Matrices

4.8: Cell-surface Biotinylation Assay

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

Las células pueden tomar sustancias del medio extracelular por endocitosis y activamente liberar moléculas en ella por exocitosis. Tales procesos incluyen sacos de membrana-limite de lípidos llamados vesículas. Conocimiento de la arquitectura molecular y mecanismos de ambos son clave para entender la fisiología normal de la célula, así como los Estados de enfermedad que ocurren cuando se vuelven defectuosos.

Este video primero revisaremos brevemente algunos descubrimientos fundamentales en la historia de la investigación de endo – y exocitosis. A continuación, algunas claves se examinarán cuestiones, seguida por una discusión de los métodos importantes para investigar estos problemas, incluyendo etiquetado celular, ensayos de fusión y proyección de imagen de fluorescencia. Por último, explorará la investigación actual está llevando a cabo por científicos en el campo hoy.

Procedure

Vías endocíticas y exocíticas son críticas para la supervivencia celular, homeostasis celular y función del tejido. Sencillamente, la endocitosis es el proceso que utiliza una célula para tomar en las moléculas del espacio extracelular por plegamiento de su membrana alrededor de él y formando una vesícula. Exocitosis es el proceso inverso, las vesículas que liberan sustancias al espacio extracelular. Estos procesos se han sugerido para desempeñar un papel fundamental en la secreción de la hormona, internalización de receptores de membrana, inmersión de patógeno y comunicación neuronal.

Hoy, a recorrer algunos de los descubrimientos de hito en el campo de la endocitosis y exocitosis, destacar algunas de las preguntas sin respuesta, métodos notable característica que se utilizan hoy en día, y por último, explorar algunos experimentos específicos realizados para comprender mejor estos procesos.

Vamos a revisar algunos de los descubrimientos trascendentales que condujeron a la comprensión actual de endocitosis y exocitosis.

La primera documentación que se relaciona con endocitosis puede asignarse a 1882, cuando Ilya Metchnikov, utilizando un microscopio de luz, observó que las células específicas envolvió a patógenos invasores. Llamó a este proceso “la fagocitosis,” donde las células engullen patógeno vía formación de vesícula. Casi medio siglo más tarde, en 1931, Warren Lewis observó un proceso similar de formación de la vesícula cuando las células en el líquido. Llamó a este comportamiento “pinocitosis”.

Más tarde en 1953, George Palade, al examinar la organización estructural y funcional de la célula, descubrió “cueva-como” invaginaciones de las membranas y los llamaron caveolas. Él infiere que debe ser necesarias para la toma de la célula. Poco después, en 1955, Premio de Nobel Christian de Duve acuñó la endocitosis del término, que incluía “fagocitosis” y “pinocitosis”. Sin embargo, la historia de endocitosis no encima todavía.

En 1975, Michael Brown y Joseph Goldstein, con microscopia electrónica experto Richard Anderson, observada que cuando la lipoproteína de baja densidad, o LDL, se une a su receptor de superficie celular, conduce a la formación de “hoyos recubiertos”. Luego se internalizan estos hoyos y receptores del endocytose LDL. Esto fue el descubrimiento del tercer tipo, llamado “endocytosis receptor-mediado.” En el mismo año, Barbara Pearse aisló la proteína de la capa principal, una molécula de triskelion y nombrado como clatrina. Por lo tanto, este proceso también se llama “endocytosis clathrin-mediado.”

Fue todo en cuanto a endocitosis. Ahora vamos a discutir cómo aprendimos acerca de exocitosis. En 1980, el grupo de Randy Schekman generado mutantes de levadura secreción deficiente, y revelaron la presencia de genes críticos que codificados para proteínas necesarias para la exocitosis.

En 1993, James Rothman identificado algunas de estas proteínas y según su naturaleza química fueron llamados trampas. En su seminal, “Hipótesis de la trampa,” propuso que estas estructuras helicoidales gancho a otras, haciendo que las membranas se acerquen con fuerza suficiente como para fundir y generar exocitosis.

Al mismo tiempo, Thomas Südhof estableció que este proceso fue también fuertemente controlado en las neuronas por proteínas sensoras del calcio llamadas synaptotagmins que fomentó y con precisión tiempo de fusión de la vesícula para la liberación de neurotransmisor. Juntos, estos científicos recibieron el Premio Nobel en 2013.

A pesar de la amplitud de estos descubrimientos, siguen siendo muchos rompecabezas intrigantes. Echemos un vistazo a algunas de las preguntas que se están estudiando hoy en día.

Los científicos están empezando a preguntar cómo las funciones de endocitosis y exocitosis van más allá de adquirir y secretar sustancias. ¿Por ejemplo, cómo son continuamente liberados por las vesículas de neurotransmisores fusión a la membrana celular sin una catastrófica expansión del tamaño de la célula? Tratan de identificar las señales que provocan las células internalizar la membrana, con el fin de compensar la expansión y reciclar recursos.

Otro tema interesante es: ¿qué componentes conforman la sofisticada maquinaria molecular que impulsa estos procesos? Por ejemplo, la fagocitosis exige deformaciones de la membrana grande para rodear los patógenos invasores. Los científicos están investigando cómo citoesqueleto proteínas como actina contribuyen a membrana espectacular remodelación.

Por último, puesto que la exocitosis y endocitosis aberrante pueden resultar en enfermedades graves, los científicos están interesados en entender qué causa esta disregulación. Una de las proteínas siendo examinadas es α-sinucleína, cuya secreción de las neuronas se ha implicado en la muerte progresiva de las neuronas cercanas. Entender su exocitosis podría proporcionar información valiosa en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson.

Ahora que nos hemos considerado algunas de las preguntas clave que se está investigadas, vamos a ver qué herramientas están disponibles para responderlas.

Los investigadores utilizan un ensayo de Biotinilación de células endocitosis de proteínas de la superficie de la célula de seguimiento. Este proceso implica una proteína superficial con biotina fluorescencia etiquetada de etiquetado y luego permitiendo que la célula a endocitosis. Esto puede ser seguido por análisis inmune de la mancha, revelando la internalización de proteínas.

Para cuantificar la vesícula neuronal reciclaje, muchos científicos etiqueta células con moléculas fluorescentes específicos de membrana, como tintes de FM. Estos colorantes se unen estable al prospecto externo y sólo son internalizados por endocitosis. Después de estimulación secuencial, son exocytosed. Analizando el lanzamiento con un microscopio de fluorescencia permite la penetración más profunda en todo el proceso de reciclaje.

A menudo, para manipular y comprender las contribuciones de los componentes que permiten la exocitosis, los científicos establecer ensayos de fusión. Dos conjuntos de vesículas con contenido distinto colorante fluorescente están preparados y entrar juntos. Fusión entre ellos resulta en la formación de un nuevo producto, que puede ser controlado usando un lector de microplacas.

Por último, sofisticados métodos de imagen, incluyendo fluorescencia la proyección de imagen y de la fluorescencia vive la proyección de imagen de la célula, presentan a los investigadores una oportunidad única para las estructuras morfológicas de imagen y eventos moleculares de endocitosis y exocitosis.

Finalmente, Veamos algunas maneras específicas en que los científicos están implementando estas herramientas en los laboratorios de hoy.

Biólogos de la célula están interesados en estudiar cómo exocitosis ayuda a sanar las membranas lesionadas. Aquí, los investigadores primero habían herido células en solución de tintes FM haciendo rodar los granos de cristal sobre ellos. Proyección de imagen de fluorescencia posterior muestra que si la tasa de exocitosis es rápida, rápidamente sellar la membrana y deje de FM que se escapa en la célula. Cuando exocitosis es lento, resulta amplia tinción intracelular de FM.

Investigadores pueden utilizar ensayos de fusión para el aporte de proteínas de fusión específica del modelo. Aquí, los investigadores expresan proteínas de la membrana asociada a vesículas diferentes o “VAMPs”, que son proteínas SNARE, en la superficie de dos grupos de células. La fusión entonces fue permitida tomar lugar, y el resultado fue cuantificado usando un espectrómetro. Usando esta configuración, los científicos pudieron comparar las eficacias de la fusión de varios VAMPs.

Por último, los investigadores aspiran a comprender la endocitosis de receptor de superficie celular en respuesta a un fármaco. Aquí, los científicos trataron etiquetas fluorescencia células con una droga, y receptor visualizado medicados endocitosis ocurre en tiempo real utilizando microscopía de Time-lapse.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a endocitosis y exocitosis. En este video, revisamos los puntos históricos a partir del descubrimiento de la fagocitosis a la definición de los mecanismos de liberación de neurotransmisor. A continuación, presentamos algunas preguntas claves que piden. También exploran estrategias de investigación prominentes y discuten algunas de sus aplicaciones actuales. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Endocytic and exocytic pathways are critical for cellular homeostasis, tissue function, and overall cell survival. Simply put, endocytosis is the process that a cell uses to take in molecules from the extracellular space by folding its membrane around it and forming a vesicle. Exocytosis is the reverse process, which uses vesicles to release substances to the extracellular space. These processes have been suggested to play a critical role in hormone secretion, membrane receptor internalization, pathogen engulfment, and neuronal communications.

Today, we’ll retrace some of the landmark discoveries in the field of endocytosis and exocytosis, highlight some of the unanswered questions, feature notable methods that are used today, and lastly, explore a few specific experiments performed to better understand these processes.

Let’s revisit some of the momentous discoveries that led to the current understanding of endocytosis and exocytosis.

The first documentation related to endocytosis can be mapped back to 1882, when Ilya Metchnikov, using a light microscope, observed that specific cells engulfed invading pathogens. He called this process “phagocytosis,” where cells engulf pathogen via vesicle formation. Almost half a century later, in 1931, Warren Lewis observed a similar process of vesicle formation when cells took in fluid. He named this behavior “pinocytosis.”

Later in 1953, George Palade, while examining the structural and functional organization of the cell, discovered “cave-like” invaginations of the membranes, and called them caveolae. He inferred that these must be required for cell-intake. Soon after, in 1955, Nobel laureate Christian de Duve coined the term endocytosis, which encompassed “phagocytosis” and “pinocytosis.” However, the story of endocytosis wasn’t over yet.

In 1975, Michael Brown and Joseph Goldstein, with electron microscopy expert Richard Anderson, observed that when low density lipoprotein, or LDL, binds to its cell surface receptor, it leads to formation of “coated pits.” These pits are then internalized, and endocytose LDL receptors. This was the discovery of the third type, called “receptor-mediated endocytosis.” In the same year, Barbara Pearse isolated the major coat protein, a triskelion molecule, and named it as clathrin. Therefore, this process is also called “clathrin-mediated endocytosis.”

That was all regarding endocytosis. Now let’s discuss how we learned about exocytosis. In 1980, Randy Schekman’s group generated yeast mutants that were secretion deficient, and revealed the presence of critical genes that coded for proteins necessary for exocytosis.

In 1993, James Rothman identified some of these proteins, and based on their chemical nature they were called SNAREs. In his seminal, “SNARE hypothesis,” he proposed that these helical structures hook on to each other, causing membranes to come closer with sufficient force to fuse and generate exocytosis.

Around the same time, Thomas Südhof established that this process was also tightly controlled in neurons by calcium-sensing proteins called synaptotagmins that fostered and accurately timed vesicle fusion for neurotransmitter release. Together, these scientists were awarded the Nobel Prize in 2013.

Despite the breadth of these discoveries, many intriguing puzzles remain. Let’s take a look at some of the questions being explored today.

Scientists are starting to ask how the functions of endocytosis and exocytosis go beyond acquiring and secreting substances. For example, how are neurotransmitters continuously released by vesicles fusing to the cell membrane without a catastrophic expansion of cell size? They are trying to identify signals that cause cells to internalize membrane, in order to offset the expansion and recycle resources.

Another interesting topic is: what components make up the sophisticated molecular machinery that drives these processes? For example, phagocytosis necessitates large membrane deformations to surround invading pathogens. Scientists are investigating how cytoskeletal proteins like actin contribute to dramatic membrane remodeling.

Lastly, since aberrant endocytosis and exocytosis can result in serious diseases, scientists are interested in understanding what causes this dysregulation. One of the proteins being scrutinized is α-synuclein, whose secretion from neurons has been implicated in the progressive death of nearby neurons. Understanding its exocytosis could provide valuable insights on the treatment of neurodegenerative diseases like Parkinson’s.

Now that we’ve considered some of the key questions being investigated, let’s see what tools are available to answer them.

Researchers use a cell biotinylation assay to track endocytosis of cell surface proteins. This process involves labeling a surface protein with fluorescently tagged biotin, and then allowing the cell to undergo endocytosis. This can be followed by immune blot analysis, revealing protein internalization.

In order to quantify neuronal vesicle recycling, many scientists label cells with membrane-specific fluorescent molecules, like FM dyes. These dyes bind stably to the outer leaflet, and are only internalized by endocytosis. Following sequential stimulation, they are exocytosed. Analyzing release with a fluorescence microscope allows deeper insight into the whole recycling process.

Often, to manipulate and understand the contributions of components that allow exocytosis, scientists set up fusion assays. Two sets of vesicles with distinct fluorescent dye contents are prepared and allowed to come together. Fusion between them results in formation of a new product, which can be monitored using a microplate reader.

Lastly, sophisticated imaging methods, including fluorescence imaging and fluorescence live cell imaging, present researchers with the unique opportunity to image morphological structures and molecular events of endocytosis and exocytosis.

Finally, let’s look at some specific ways in which scientists are implementing these tools in labs today.

Cell biologists are interested in studying how exocytosis helps heal injured membranes. Here, researchers first injured cells in solution of FM dyes by rolling glass beads over them. Subsequent fluorescence imaging shows that if the rate of exocytosis is fast, it will quickly seal up the membrane and stop FM leaking into the cell. When exocytosis is slow, it results in extensive intracellular FM staining.

Researchers can use fusion assays to model the contribution of specific fusion proteins. Here, researchers expressed different vesicle-associated membrane proteins or “VAMPs,” which are SNARE proteins, on the surface of two pools of cells. The fusion was then allowed to take place, and the result was quantified using a spectrometer. Using this setup, scientists were able to compare the fusion efficiencies of multiple VAMPs.

Lastly, researchers are aiming to understand cell surface receptor endocytosis in response to a drug. Here, scientists treated fluorescently tagged cells with a drug, and visualized receptor medicated endocytosis happening in real time using time-lapse microscopy.

You’ve just watched JoVE’s introduction to endocytosis and exocytosis. In this video, we reviewed the historical highlights starting from the discovery of phagocytosis to defining the mechanisms of neurotransmitter release. Next, we introduced a few key questions being asked. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

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